酸、適配體、抗體或其碎片或部分、激素、激素拮抗物、生長因 子或重組體生長因子及其碎片和變體、細胞因子、酶、抗生素或抗菌化合物、病毒、抗病毒 劑、毒素、前體藥物、化療劑、小分子、藥物和它們的組合。
[0100] 26.如段落24或25所述的方法，還包括以下步驟：將絲膜在溶解甘油的液體中浸 漬一段時間以從所述絲膜排出甘油；和將甘油缺失的膜干燥。
[0101] 27.如段落24~26中任一項所述的方法，還包括將所述膜退火。
[0102] 實施例
[0103] 實施例1.絲纖蛋白提純
[0104] 按照之前的描述制備絲纖蛋白IC備水溶液。Sofia等人，54J. Biomed. Mater. Res. 139-48 (2001)。簡單的說，將家香（Bombyx mori)的苗在 0. 02M 碳酸鈉 的水溶液中煮沸20min，然后用純水徹底漂洗。干燥后，將提取的絲纖蛋白溶于60 °C 的9. 3M LiBr溶液4小時，得到20% (w/v)溶液。使用SUDE-A-LYZER.?滲析盒， 3, 500MWC0 (Pierce，Rockford，IL)將該溶液用蒸餾水滲析3天以除鹽。滲析后，溶液是光學 透明的，離心除去在該過程中形成的少量絲聚集體，絲聚集體通常來自繭上存在的環境污 染物。絲纖蛋白水溶液的最終濃度為大約6% (w/v)。通過在干燥后稱量已知溶液體積的 殘余固體重量而測定該濃度。
[0105] 在使用前將6%絲纖蛋白溶液儲存于4°C下，并可以用超純水稀釋至較低濃度。為 了獲得具有較高濃度的絲纖蛋白溶液，可以將6%絲纖蛋白溶液用吸濕性聚合物（如聚乙 二醇（PEG)、淀粉酶或絲膠）滲析。例如，可以使6%絲纖蛋白溶液在SL丨DE-A-LYZER? 3, 500MWC0滲析盒外部在滲透壓下接觸25 %~50% wt %的PEG (Mff 8, 000~10, 000)溶液 2~12小時，絲水溶液的最終濃度被濃縮到8%~30% wt%或更大。
[0106] 實施例2絲/甘油共混物膜的制備
[0107] 以0%、5%、10%、20%、30%、40%、50% (w/w)的重量比將提純的絲纖蛋白溶液 與甘油混合。將混合溶液倒入Petri培養皿并在層流凈化罩中室溫下干燥過夜。除非另有 說明，"干共混物膜"指的是通過這種直接流延并干燥過夜而制備的膜，"濕共混物膜"指的 是相同的經過流延和干燥的膜，隨后在37°C的超純水中從其中提取甘油1小時，然后將膜 在空氣中再次干燥。對于處理組中的另外變量，使用甲醇處理，并且在這些情況下將膜（含 有甘油和沒有甘油）在90% (v/v)甲醇中浸漬1小時，然后空氣干燥。
[0108] 實施例3.絲/甘油膜的溶解
[0109] 將共混物膜切成大約5mm X 5mm的正方形，將一個正方形膜稱重并在2ml管的超純 水中浸浸，至濃度為1% (膜的重量/水的體積），并在37°C下保持1小時或1天。溫孵后， 將絲膜從溶液中取出，空氣干燥過夜，稱重，并與初始膜的質量相比以獲得殘余質量（％ )。 對殘余溶液進行280nm下的紫外線吸光度測量。使用不同濃度下的經提純的絲纖蛋白溶液 作為標準，將吸光度值轉化成在水中溶解的絲量。然后將溶解的絲量與膜中的總絲質量相 比，以獲得膜在水中溶解的絲的百分比。
[0110] 實施例4.通過傅里葉變換紅外（FTIR)光譜分析絲/甘油膜
[0111] 使用紅外吸收光譜的傅里葉自去卷積（FSD)評價膜中存在的二級結構，包括無規 卷曲、α -螺旋、β -折疊片和轉角。經處理的樣品的FTIR分析使用Bruker Equinox 55/S FTIR光譜儀（Bruker Optics Inc. ,Billerica, MA)進行，該光譜儀配備有氖化三甘氨酸硫 酸酯檢測器和含有鍺（Ge)晶體的多重反射的水平MIRacle? ATR附件，來自Pike Tech. (Madison, WI)。將5mmX5mm正方形絲膜置于Ge晶體池中并用FTIR顯微鏡以反射模式檢 驗。用空池進行背景測量并從樣品讀數中扣除。對于每次測量，以4cm 1的分辨率記錄64 次掃描，波數范圍是400cm1~4000cm 1D
[0112] 按照之前的描述使用 Opus 5. 0 軟件（Opus Software, Inc.，San Francisco, CA) 進行覆蓋酰胺I區（1595cm1~1705cm 3的紅外光譜的FSD。Hu等人，39Macromolecules， 6161-70(2006)。頻率范圍1616cm 1~1637cm 1和1695cm 1~1705cm 1內的吸收帶表示富 集的β-折疊結構；1638cm1~1655cm 1范圍內的吸收帶歸于無規卷曲結構；1656cm 1~ 1663cm1范圍內的吸收帶歸于α -螺旋；1663cm 1~1695cm 1范圍內的吸收帶歸于轉角。參 見，同上。
[0113] 實施例5.絲/甘油膜的機械性能
[0114] 拉伸試驗在Instron 3366試驗架上進行，該試驗架配備有10N容量的負載傳感器 和BI0PULS?試驗系統（丨n、tron^. Norwood，MA)，包括能潛入的氣動夾和溫控液浴。基于 ASTM標準D638-02a，將膜樣品澆注到硅樹脂模具中，并按比例增大2 X，得到80mm的總長 度，以適應夾持所需的大表面和視頻伸長測定法所需的量規長度（28mm)。對于干環境，將膜 在25°C和50%相對濕度的環境室中調節兩天。對于濕環境，將絲/甘油膜樣品在0.1 M磷 酸鹽緩沖鹽水（PBS)中水合1小時，然后在裝滿PBS的BI0PULS?浴（37±0. 3°C )中浸漬 至少5min，然后試驗。將純的絲纖蛋白膜（0%甘油）用90% v/v甲醇預處理1小時，然后 按照與甘油樣品相同的方式處理。所有膜均基于初始夾子到夾子長度（額定長度約47mm， 額定伸長率約2. 82mm/min)以0. 1% s 1的應變控制速率進行試驗。在20Hz下捕捉負載和 視頻伸長計應變數據，后者基于以約Icm的額定距離置于每個膜的最薄部分表面上的兩個 基準油漆標記。對每個膜試驗重復五次。初始截面積通過用SEM測量膜厚并乘以樣品寬度 (IOmm)而測定。對于額定應力和應變繪圖，測定初始"線性彈性模數'致損應變和極限抗 拉強度（UTS)。UTS作為試驗中獲得的最高應力值測定。初始"線性彈性模數"通過使用對 應于0.1 N負載的點與對應于50% UTS的點之間的最小二乘法擬合計算出來。這被認為足 以客觀地捕捉所有被試驗樣品的應力/應變曲線的線性部分。致損伸長率作為>10%的負 載減小之前的最后數據點測定。
[0115] 實施例6.掃描電子顯微鏡法（SEM)
[0116] 使絲膜在液氮中斷裂并用鉑濺射。使用Zeiss SUPRA?55VP SEM(Carl Zeiss, Inc.，Jena, Germany)對不同絲膜的橫截面和表面形態進行成像。
[0117] 實施例7.絲膜上的成纖維細胞培養和粘附
[0118] 在含有90%01^1、10%胎牛血清$83)、1001]/1111青霉素、10001]/1111鏈霉素的生 長培養基中使成纖維細胞增殖。在具有95%空氣和5% CO2的恒溫箱中在37°C下保持細 胞培養物。培養物每隔一天補充37°C的新鮮培養基。為了粘附，在24孔板中預先流延 的絲膜上接種細胞，每個孔在Iml含血清培養基中具有50, 000個細胞。具有組織培養塑 料（TCP)但沒有絲的空孔充當對照。在細胞接種3小時后，通過將50 μ 1的Alamar藍加 到培養基中，再培養6小時，并測定培養基焚光（Ex = 560nm，Em = 590nm)，從而評價細 胞附著。在培養期間，使用Alamar藍染色測定細胞增殖，并通過相差光顯微鏡法（Carl Zeiss, Inc.，Jena, Germany)監視細胞形態。
[0119] 所有實驗對于每個數據點均進行最少N = 3次。通過單因素方差分析（ANOVA)和 Student-Newman-Keuls Multiple Comparisons Test 進行統計分析。當 p <0· 05 時認為 差異顯著，并且當P < 0. 01時認為差異非常顯著。
【主權項】
1. 一種絲膜，其含有絲纖蛋白和約10%~50% (w/w)的甘油。2. 如權利要求1所述的絲膜，其中所述絲膜的甘油含量為約20%~40% (w/w)。3. 如權利要求1或2所述的絲膜，其中所述絲膜的甘油含量為約30% (w/w)。4. 如權利要求1~3中任一項所述的絲膜，還含有至少一種活性劑。5. 如權利要求1~4中任一項所述的絲膜，還含有嵌在所述絲膜中的絲微米球或絲納 米球。6. 如權利要求1~5中任一項所述的絲膜，其中所述膜層疊或折疊成海綿或阻塞物。7. 如權利要求1~6中任一項所述的絲膜，其中所述至少一種活性劑選自細胞、蛋白、 肽、核酸類似物、核苷酸或寡核苷酸、肽核酸、適配體、抗體或其碎片或部分、激素、激素拮抗 物、生長因子或重組體生長因子及其碎片和變體、細胞因子、酶、抗生素或抗菌化合物、病 毒、抗病毒劑、毒素、前體藥物、化療劑、小分子、藥物和它們的組合。8. -種用于組織工程的構建體，其包括如權利要求1~7中任一項所述的絲膜，其中至 少一種活性劑是細胞。9. 如權利要求8所述的用于組織工程的構建體，其中所述細胞選自肝細胞、胰島細胞、 成纖維細胞、軟骨細胞、成骨細胞、外分泌細胞、腸源細胞、膽管細胞、甲狀旁腺細胞、甲狀腺 細胞、腎上腺-下丘腦-垂體軸的細胞、心肌細胞、腎上皮細胞、腎管狀細胞、腎基膜細胞、 神經細胞、血管細胞、形成骨和軟骨的細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、口腔細胞、外皮細胞、 骨髓細胞、角質細胞、多能細胞、誘發的多能干細胞、成熟干細胞和胚胎干細胞、和它們的組 合。10. 如權利要求9所述的用于組織工程的構建體，其中組織工程的構建體是角膜組織 構建體并且所述細胞是角膜成纖維細胞。11. 如權利要求8~10中任一項所述的用于組織工程的構建體，還含有細胞生長培養 基。12. 如權利要求1~7中任一項所述的絲膜，還包括在所述絲膜上的光學圖案。13. 如權利要求12所述的絲膜，其中所述光學圖案是全息圖像。
【專利摘要】本發明提供用于制備不溶于水、展延性、柔性的絲纖蛋白膜的組合物和方法。這種絲膜含有絲纖蛋白和約10％～50％(w/w)的甘油，并通過完全的含水過程制備。這種展延性絲膜可以通過從絲膜提取甘油并將絲膜再次干燥而進一步處理。可以將活性劑嵌入甘油改性的絲膜或者沉積于其上，從而適于多種醫療應用。這種膜可以成型為三維結構，或者放在支撐表面上作為標簽或涂層。本發明的甘油改性的絲膜可用于多種應用，如組織工程、醫療裝置或植入體、藥物遞送以及可食用藥物或食品標簽。
【IPC分類】A61L27/22, A61L27/38, A61L27/00, A61L27/54, A23L19/00
【公開號】CN105268020
【申請號】CN201510569999
【發明人】盧神州, 王曉沁, 菲奧倫佐·奧米內托, 戴維·L·卡普蘭
【申請人】塔夫茨大學信托人
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2009年10月9日
【公告號】CA2739487A1, CN102271724A, CN102271724B, EP2349367A2, EP2349367A4, US20110223153, US20160038637, WO2010042798A2, WO2010042798A3