含有甘油的改性絲膜的制作方法
【專利說明】
[0001] 政府支持
[0002] 本發明是在由美國國家衛生研究院授予的資助金號EB002520和美國空軍科學研 究處授予的資助金號FA9550-07-1-0079的政府支持下完成的。美國聯邦政府對本發明擁 有一定的權利。
[0003] 相關申請的交叉引用
[0004] 本申請根據35USC. § 119(e)要求于2008年10月9日提交的美國臨時申請號 61/104, 135的優先權，在此將其內容整體引入作為參考。
技術領域
[0005] 本發明提供用于制備含有甘油并具有改進的機械性能的絲纖蛋白（silk fibroin)膜的組合物和方法。
【背景技術】
[0006] 絲纖蛋白具有優異的成膜能力，并且也適合用在人體中。由于占主導的無規卷曲 的蛋白結構，因而未經進一步操作或處理的絲纖蛋白膜可溶于水。通過若干處理，可以將蛋 白的結構特征從無規卷曲轉變成β -折疊結構，所述處理包括機械拉伸、在極性有機溶劑 中浸漬或在水蒸汽中固化。這種結構轉變導致水不溶性，因此提供將材料用于一定范圍的 生物醫學和其他應用的選擇。一些純的絲纖蛋白膜趨于隨著時間在干狀態下變硬和變脆， 然而卻表現出令人印象深刻的抗拉強度，但是展延性低。仍然需要改變絲纖蛋白膜的物理 和機械性能，以改善機械性能并提供用于生物醫學和其他應用的更為柔性的基于絲纖蛋白 的體系。
【發明內容】
[0007] 本發明提供含有絲纖蛋白和甘油的膜，與缺乏甘油的絲纖蛋白膜相比，它具有不 同的性能。更具體地說，通過使用或者包含并使用甘油作為增塑劑，水溶性和生物適應性得 到提高。在水中處理絲纖蛋白也提高了生物適應性和負載生物活性化合物而無損功能的潛 力，并為這些生物材料增加了"綠色化學"價值。例如，流延成膜的甘油濃度超過30% (w/ w)的絲纖蛋白和甘油的共混物引起絲二級結構從無規卷曲轉變成α-螺旋，防止絲經水合 而溶解，提供了不同的膜納米結構形態，改進了膜在干（流延后未經處理（as-cast)的膜） 或濕（浸出甘油后）環境中的柔性，并保持細胞生物適應性。在機械上，甘油可以在絲纖蛋 白鏈水合中替換水，與無規卷曲或折疊結構相反，引起螺旋結構的初始穩定化。甘油對 穩定化的膜結構、水不溶性和功能的影響在甘油濃度超過約20wt %甘油時明顯發生。在材 料處理中甘油與絲纖蛋白的組合使用擴大了可由纖維狀蛋白得到的功能特征，并且形成在 生物材料和裝置應用中具有潛在用途的更為柔性的膜。
[0008] 本發明提供一種絲膜，其含有絲纖蛋白和約10%~50% (w/w)的甘油，其中所述 膜通過完全含水過程制備，并且所述絲膜具有延展性且基本不溶于水。本發明的絲/甘油 共混物膜的許多實施方案任選地經過甲醇處理或水退火表現出比缺乏甘油的絲膜更高的 展延性。盡管不限于理論的束縛，但是絲纖蛋白膜中的甘油似乎使絲纖蛋白的Ct-螺旋結 構穩定。因此，在一個實施方案中，通過從絲膜提取甘油并將膜再次干燥，可以將展延性絲 纖蛋白膜從Ct -螺旋結構轉化成β -折疊結構。
[0009] 在一個實施方案中，含有甘油改性的絲膜的組合物可以用作用于組織工程的二維 或三維構建體，并且還可含有至少一種活性劑。這種組織工程的構建體可用于器官修復、器 官替換或其他再生組織材料（如心肌或角膜組織）。三維組織工程的實施方案可以通過在 裝置或植入體（如牙科植入體）周圍用展延性絲/甘油膜纏繞或成型，并使膜干燥而完成。 絲/甘油共混物可以形成或者膜可以折疊或成型成海綿或阻塞物或其他三維結構。任選 地，然后可以將甘油從絲中浸出。因此，通過用絲/甘油展延性膜涂布生物醫學材料（如醫 療裝置、組織工程的材料或植入體）的表面，絲膜也可用作這些結構上的涂層。從這種改性 絲膜形成的涂層提供了改善的相容性并良好地符合基材輪廓。
[0010] 在另一個實施方案中，含有甘油的絲纖蛋白膜是一種包括基于絲的結構（如絲纖 蛋白納米球（nanosphere)或微米球（microsphere))并任選含有活性劑的復合材料。另 外，絲復合材料可以包括基于絲的復合物的支撐表面，如醫療植入體或裝置的三維結構，展 延性甘油/絲膜在其上成型。
[0011] 本發明的實施方案也提供制備基本不溶于水的絲膜的方法，所述方法包括：將絲 纖蛋白溶液與甘油共混，其中甘油在絲纖蛋白/甘油共混物溶液中的濃度為約10%~50% (w/w);在膜支撐表面上流延所述絲纖蛋白/甘油共混物溶液；和將膜干燥。通過該過程制 備的絲膜與缺乏甘油的絲膜相比表現出增大的展延性。
[0012] 通過在流延和干燥膜之前，將絲纖蛋白溶液與至少一種活性劑及甘油共混，可以 將至少一種活性劑嵌在展延性絲膜中。類似地，可以將細胞或組織嵌在絲/甘油共混物膜 中。
【附圖說明】
[0013] 圖1顯示來自共混物膜的絲和甘油的溶解數據。*組間的顯著差異（p〈0. 01)。數 據表示平均值（ave) 土標準偏差（SD) (η = 4)。
[0014] 圖2A-2C顯示具有不同甘油含量的共混物膜中的絲二級結構的FTIR測量。圖2Α : 膜流延后即刻的共混物膜。圖2Β :90% (v/v)甲醇處理1小時后的共混物膜。圖2C:經水 處理1小時和未經水處理的20% (w/w)甘油膜。*組間的顯著差異（ρ〈0. 01)。數據表示 ave 土 SD (η = 4)。
[0015] 圖3A-3D表示具有不同甘油含量的共混物膜的機械性能。圖3Α，抗拉強度。圖3Β， 斷裂伸長率。圖3C，干共混物膜的拉伸模量。圖3D，水處理1小時后的濕共混物膜的拉伸 模量。*組間的顯著差異（Ρ〈〇. 01)。數據表示ave土SD (η = 5)。
[0016] 圖4A-4D顯示共混物膜的SEM圖像。圖4Α，甘油含量10% (w/w)。圖4Β，甘油含 量20% (w/w)。圖4C，甘油含量30% (w/w)，經水處理1小時。圖4D，甘油含量0%，經甲醇 處理 1 小時。標尺（scale bar) = 200nm〇
[0017] 圖5A-?是顯示經水處理的含有30% (w/w)甘油絲膜中的納米絲結構的顯微照 片。圖5A和圖顯示膜中的不同區域。圖5B，圖5A的高倍放大。圖5C，圖5A的側視圖。 圖5E，圖ro的高倍放大。在圖5A、圖5C、圖ro中，標尺=200nm ;在圖5B、圖5E中，標尺= IOOnm0
[0018] 圖6A和圖6B說明成纖維細胞在不同表面上的附著和增殖。圖6A顯示在30% (w/w)甘油/絲膜、純絲膜和組織培養塑料（TCP)上培養的成纖維細胞的顯微圖像。圖6B 顯示成纖維細胞在不同膜上的附著。圖6C顯示成纖維細胞在不同膜上的增殖。數據表示 ave±SD(n = 6)〇#R=50ym〇
[0019] 圖7是甘油共混的絲膜中的絲結構轉變的示意圖。
【具體實施方式】
[0020] 應當理解，本發明并不限于本文所描述的特定方法、方案和試劑等，這些都可以變 化。本文所使用的術語其目的僅僅在于描述特定的實施方案，并不意味著對本發明范圍的 限定，本發明的范圍僅僅由權利要求書限定。
[0021] 在本文及權利要求書中所用的單數形式也包含復數的含義，反之亦然，除非文中 另行明確指出。除了在操作實施例中或另外指出的情況以外，本文用以表示組分的量或反 應條件的所有數值在所有情況下都應理解為由術語"約"修飾。
[0022] 出于記載和公開的目的，在此以引用的方式清楚地將本發明指明的所有專利文獻 和出版物并入，例如，在這些出版物中描述的可用于本發明的方法學。提供這些出版物僅僅 是因為它們的公開早于本申請的申請日。在這一點上，任何事物不應被解釋為對本發明者 無權因在先發明或因任何其他原因使本發明的內容早于這些公開內容的承認。所有關于日 期的陳述或關于這些文件內容的表達均基于申請人可以獲得的信息，不構成對這些文件的 日期或內容的正確性的任何承認。
[0023] 除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域的普通技術人 員通常理解的含義相同。雖然在本發明的實施或測試中可使用任何已知的方法、裝置和原 料，但是在這方面本文仍對方法、裝置和原料進行了描述。
[0024] 絲纖蛋白具有優異的成膜能力，并且也適合用在人體中。Altman等人， 24Biomats. , 401-16(2003) ；Vepari&Kaplan, 32Prog. Polym. Sci. 991-1007(2007) 〇 絲纖 蛋白膜在濕的狀態下具有良好的溶解氧滲透性，與人皮膚類似，表明這些膜在創傷敷料 和人造皮膚系統中的潛在應用。Minoura等人，IlBiomats. ,430-34(1990) ;Minoura等 人，31Polymer, 265-69 (1990a)。然而，由于占主導的無規卷曲的蛋白結構，因而未經進 一步操作的由絲纖蛋白形成的膜可溶于水。通過熱處理（Hu等人，41Macromolecules 3939-48(2008))、機械拉伸（Jin&Kaplan, 424Nature 1057-61 (2003))、在極性有機溶劑中 浸漬（Canetti 等人，28Biopolymers_Peptide Sci. § 1613-24(1989))和在水蒸汽中固化 (Jin等人，15Adv. Funct. Mat. 1241-47 (2005))，可以將蛋白的結構特征從無規卷曲轉變成 β -折疊形式。這種結構轉變導致水不溶性，因此提供將材料用于一定范圍的生物醫學和其 他應用如傳感器平臺的選擇。Zhang, 16Biotechnol. Adv. 961-71 (1998)。一些純的絲纖蛋 白膜趨于隨著時間在干狀態下變硬和變脆，然而卻表現出令人印象深刻的抗拉強度，但是 伸長率低。J in等人，2005。因此，仍然需要改變絲膜的物理和機械性能，以主要是向著更為 柔性的體系來控制性能。
[0025] 將聚合物與增塑劑共混是實現上述展延性和抗拉強度的傳統方法。例如，一 些研究表明，可以通過將絲與其他合成或天然聚合物共混而改變絲膜性能，所述的聚合 物例如是藻酸鹽、聚烯丙胺、殼聚糖、纖維素、聚（己內酯-共-D，L-丙交酯）、S-羧甲 基角蛋白、聚乙稀醇（PVA)、聚乙二醇和聚環氧乙燒 。SMLiang&Hirabayashi，45J. Appl. Polymer Sci. 1937-43(1992) ;Arai 等人，84J. Appl. Polymer Sci. 1963-70(2002); Kitagawa&Yabuki，80J.Appl. Polymer Sci. 928-34(2001) ;Noishiki 等人，86J. Appl. Polymer Sci. 3425-29 (2002) ;Kesenci 等人，12J. Biomats· Sci. Polymer Ed. 337-51 (2001) ;Lee 等人，9J. Biomats· Sci. Polymer Ed. 905-14 (1998) ;Tsukada 等人， 32J. Polymer Sci. B, 243-48 (1994) ;Gotoh 等人，38Polymer 487-90(1997) Jin 等人， 5Biomacromols. 711-17(2004)。例如，絲纖蛋白和PEO的共混物顯示出材料穩定化（Jin等 人，2004 Jin等人，3Biomacromol. 1233-39 (2002))，并且將水用作增塑劑可以改善膜性能 (Jin 等人，2005)。