除小鼠可卡因自主給藥行為減弱
[0217] 實驗開始前3天，動物進行自主給藥系統環境適應，每天30min，以減小因環境導 致的實驗誤差。實驗第1天，四個指標之間沒有差異，表明在可卡因作用初期成癮效應還 沒有形成，動物的鼻觸行為是其本身的探究行為，隨著后續實驗的推進，發現動物可卡因 有效鼻觸次數不斷增加（圖13)，而生理鹽水組有效鼻觸次數在實驗過程中沒有發生顯著 變化（圖14。訓練3-4天后，與TLR3基因敲除小鼠相比，野生型小鼠可卡因有效鼻觸次 數顯著增加（P〈〇. 05)，而無效鼻觸次數與初始水平無差異，說明野生型小鼠在可卡因的作 用下具備了辨別有效鼻觸器和無效鼻觸器的能力，建立起操作性條件反射，相反，這恰恰 說明TLR3基因敲除小鼠通過碰觸有效鼻觸器來獲得藥物獎賞的行為顯著減少。在生理鹽 水組動物的實驗中，TLR3基因敲除小鼠和野生型小鼠的有效鼻觸次數和無效鼻觸次數在整 個實驗進程中沒有明顯差異，說明兩者均不能辨別有效鼻觸器和無效鼻觸器（圖15)。此 外，從實驗第5天開始，野生型小鼠可卡因有效鼻觸次數（藥物注射次數）保持在一個 比較穩定的水平，說明自身給藥訓練使得可卡因對動物碰觸有效鼻觸器來獲得藥物獎賞 這一行為進行了加強和鞏固，然而，生理鹽水則沒有發揮上述作用。由圖15得出，TLR3基 因敲除小鼠和野生型小鼠對可卡因的需求均呈現出逐漸增長的趨勢，到第5天開始趨于平 穩，出現一個平臺期（同一組動物連續三天打藥次數在其平均值的10%范圍以內），但是， 與野生型小鼠相比，TLR3基因敲除小鼠可卡因的攝入量明顯減少（p〈0. 05)。以上實驗結果 說明TLR3基因敲除導致小鼠對可卡因的需求減弱。
[0218] 3. 5TLR3基因敲除小鼠腦內注射TLR3表達慢病毒后增強可卡因CPP效應
[0219]TLR3基因敲除小鼠腦內定位注射TLR3表達慢病毒載體，注射點為雙側伏隔核。動 物創傷恢復后，心臟灌注并固定大腦，冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察病毒注射位置（圖16)。 動物進行3天適應性訓練，每天15-20min。通過可卡因的條件性位置偏好檢測，與腦內注射 病毒載體對照的動物相比，注射了TLR3慢病毒載體的小鼠在可卡因誘導箱體停留的時間 顯著增長（P〈〇. 05)，這說明腦內注射TLR3表達慢病毒后，TLR3敲除小鼠的可卡因成癮效應 明顯增強，該結果（圖17)表明：當TLR3敲除小鼠伏隔核TLR3重新表達后，可以恢復可卡 因成癮行為效應。
[0220] 3.6TLR3基因敲除小鼠腦內注射TLR3表達慢病毒增加可卡因自發活動
[0221] TLR3基因敲除小鼠腦內雙側伏隔核注射TLR3表達慢病毒載體，動物創傷恢復后， 隨機分組并進行環境適應訓練，每次30min，以減小環境對實驗結果的影響。正式開始實驗 前3天測自發活動基線，實驗第4天開始腹腔給予可卡因。由圖18可見，四組動物前3天 的活動量處于同一水平，基礎活動量沒有明顯差異，但從第4天給藥開始，腦定位注射TLR3 表達慢病毒載體動物的自發活動量有明顯的增加，并且與注射慢病毒載體對照的動物相比 具有顯著的統計學意義（P〈〇. 05)。為使實驗結果更加客觀，消除因各組動物基礎活動量不 同對實驗結果造成的影響，將每組動物給藥后每天的自發活動量與給藥前自身基礎活動量 作比值，如圖19所示，腦定位注射TLR3表達慢病毒載體動物的自發活動量與注射慢病毒載 體對照的動物相比顯著增加，且同樣具有統計學意義（P〈〇. 05)。以上實驗結果表明：TLR3 基因敲除動物腦內伏隔核區域重新表達TLR3之后，動物的自發活動增加，可卡因引起的行 為敏化更加明顯。
[0222] 3. 7C57小鼠TLR3抑制劑腦內注射可卡因CPP效應減弱
[0223] 將C57小鼠進行TLR3抑制劑腦定位注射，動物創傷恢復后，隨機分組并進行可卡 因CPP訓練。對于腹腔注射可卡因的兩組動物，腦定位注射TLR3抑制劑小鼠條件位置偏 好效應明顯減弱（P〈〇. 05)(圖20);然而，腹腔注射生理鹽水的兩組動物無條件位置偏好效 應。以上實驗結果表明：C57小鼠腦定位注射TLR3抑制劑后，動物在可卡因誘導箱的停留 時間顯著減少，動物對可卡因的需求和依賴明顯減弱，提示TLR3基因在可卡因成癮形成中 發揮作用。
[0224] 3. 8C57小鼠TLR3抑制劑腦內注射可卡因自發活動降低
[0225]C57小鼠腦內伏隔核注射TLR3抑制劑，進行自發活動檢測。由圖21可見，4組動 物前3天的活動量處于同一水平，動物活動量基線沒有明顯差異。從第4天開始，伏隔核定 位注射TLR3抑制劑的可卡因給藥小鼠活動量增加明顯低于溶劑對照組，兩組具有統計學 差異（P〈0. 05)。該結果說明：抑制TLR3后，可減弱可卡因行為敏化效應。為使實驗結果更 加客觀，消除因各組動物基礎活動量不同對實驗結果造成的影響，將每組動物給藥后每天 的自發活動量與給藥前自身基礎活動量作比值，如圖22所示，腦定位注射TLR3抑制劑動物 的自發活動增加量明顯低于對照組的動物，且同樣具有統計學意義（P〈〇. 05)。
[0226] 3. 8可卡因多次給藥激活小鼠IKBa/NF-κB信號通路
[0227] C57小鼠經過可卡因CPP訓練后，斷頸處死，取出伏隔核（NAc)腦區，提取蛋白， 用抗ΙΚΚβ、ρΙΚΒα和NF-KB抗體進行Westernblot檢測。結果發現，可卡因CPP訓練 后，胞漿內ΙΚΚβ、ρΙΚΒα和NF-κΒ的表達明顯上調（P〈0. 05)(圖23-圖25)。對核蛋 白中NF-κΒ進行檢測，發現核內NF-κΒ表達量同樣上調（圖26) (P〈0.05)，說明胞漿中 NF-κB與磷酸化IκB分離并進入核內啟動下游信號轉導。以上結果表明，可卡因CPP訓練 使小鼠腦內ΙΚΚβ、plkBa和細胞核內外的NF-κB表達量發生變化，可卡因CPP訓練可激 活NF-IkB通路。以上實驗結果表明TLR3參與調節可卡因成癮的過程，并且提示其很可能 是通過TLR3/NF-kB途徑來實現的。
[0228] 3. 9抑制或敲除TLR3減弱IKBa/NF-κB信號轉導
[0229] 為確證TLR3參與小鼠可卡因成癮過程的調節，對C57小鼠伏隔核定位注射TLR3 抑制劑并進行可卡因CPP檢測。小鼠斷頸處死，取出伏隔核，提取蛋白，用抗pIKBa和 NF-κΒ抗體進行Westernblot檢測。結果發現，可卡因CPP訓練后，胞漿內pIKBa的 表達明顯上調（圖27)(Ρ〈0·05)，同時核內NF-κΒ表達量上調且具有統計學意義（圖28) (P〈0.05)。以上結果表明抑制伏隔核內TLR3可下調IKBa/NF-κB通路中關鍵蛋白的表達 量，即抑制TLR3可減弱IKBa/NF-κB的信號轉導。
[0230]TLR3基因敲除小鼠伏隔核定位注射TLR3表達慢病毒，并進行可卡因CPP檢測，取 出伏隔核樣本，用抗pIKBa和NF-κΒ的抗體進行Westernblot檢測。結果發現，可卡因 CPP訓練后，腦定位注射TLR3表達慢病毒的動物胞漿內pIKBa的表達明顯上調（圖29) (P〈0. 05)，同時，核內NF-κB表達量同樣上調且具有統計學意義，（圖30) (P〈0. 05)，以上結 果表明TLR3基因敲除小鼠伏隔核內TLR3基因恢復表達后，可卡因CPP訓練上調了pIKBa 和核內NF-κB的表達，說明TLR3基因恢復表達后可卡因CPP激活了IKBa/NF-κB通路。
[0231] 4 結論
[0232] 本課題主要采用行為學觀察及遺傳學和藥理學干預等手段探究TLR3在小鼠可卡 因成癮機制中的作用。
[0233] 我們發現，TLR3基因敲除小鼠可卡因CPP效應顯著降低，表明其對可卡因的依賴 減弱。與野生型小鼠相比，TLR3基因敲除小鼠對可卡因誘導的行為敏化效應減弱。在自主 給藥試驗中，TLR3基因敲除小鼠自主給藥次數明顯少于，表明對可卡因渴求減弱。
[0234] 我們構建了TLR3表達慢病毒載體，并在TLR3基因敲除小鼠伏隔核定位注射該病 毒載體以恢復TLR3表達，然后進行相關神經行為學試驗。試驗結果表明：TLR3敲除小鼠伏 隔核注射TLR3慢病毒載體后對可卡因成癮性顯著升高。
[0235] 我們繼續采用TLR3抑制劑定位注射于C57小鼠伏隔核，然后進行成癮行為學評 價。結果發現，TLR3抑制劑可減弱C57小鼠對可卡因的成癮性。
[0236] 最后，對成癮小鼠TLR3/IKK0/NF_kB通路的關鍵蛋白進行檢測。結果發現，可卡 因CPP訓練使小鼠腦內ΙΚΚβ、plkBa和細胞核內外NF-κB表達水平均上調表達。但當 C57小鼠腦定位注射TLR3抑制劑后，胞漿pIKBa和核內NF-kB均下調表達，此外，TLR3基 因敲除小鼠通過腦定位注射慢病毒載體恢復表達TLR3后，胞漿pIKBa和核內NF-κB上調 表達。以上結果說明TLR3參與可卡因成癮過程，且可能是通過TLR3/IKBa/NF-kB通路參 與調解。
[0237] 綜上，TLR3抑制劑可以有效減弱對可卡因的依賴和渴求，減弱可卡因誘導的行為 敏化效應，能夠治療可卡因成癮。
【主權項】
1. TLR3抑制劑在制備治療可卡因成癮的藥物中的用途。2. 根據權利要求1所述的用途，其特征在于：所述治療可卡因成癮的藥物是降低 ρΙΚΒα和NF-kB表達水平的藥物。3. 根據權利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述TLR3抑制劑為化合物I，其結構 式如下：Q4. 一種治療可卡因成癮的藥物，其特征在于：它是以TLR3抑制劑為活性成分，加上藥 學上可接受的輔料或者輔助性成分制備而成的制劑。5. 根據權利要求1所述的藥物有，其特征在于：所述治療可卡因成癮的藥物是降低 ρΙΚΒα和NF-kB表達水平的藥物。6. 根據權利要求4或5所述的藥物，其特征在于：所述TLR3抑制劑為化合物I，其結構 式如下：7. 根據權利要求4所述的藥物，其特征在于：所述制劑是注射制劑。
【專利摘要】本發明公開了TLR3抑制劑在制備治療成癮藥物成癮的藥物中的用途。本發明還公開了一種治療可卡因成癮的藥物，它是以TLR3抑制劑為活性成分，加上藥學上可接受的輔料或者輔助性成分制備而成的制劑。本發明TLR3抑制劑可以有效減弱對可卡因的依賴和渴求，減弱可卡因誘導的行為敏化效應，能夠治療可卡因成癮，臨床應用前景良好。
【IPC分類】A61K31/351, A61P25/30, A61K45/00
【公開號】CN105251006
【申請號】CN201510520277
【發明人】岑小波, 付登琦
【申請人】四川大學
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年8月21日