，25.0(C-6')。
[00引](+)-順式凱林內(nèi)醋：1h匪R(400MHz,CD3OD) 5 :6. 24(1H，d,J= 9.甜z，H-3)，7. 86(lH，d，J = 9.甜z，H-4)，7. 44(lH，d，J = 8.細(xì)z，H-5)，6. 76(lH，d，J = 8.細(xì)z, H-6)，3. 75 (IH, d, J = 4. 7Hz, H-3' )，5. 07 (IH d, J = 4. 7Hz, H-4' )，1. 42 (3H, s, -C H3)，1.43(3H，s，-CH3)c"C NMR(100MHz，CD3〇D) 5 :163. 4(C-2)，112. 8(C-3)，146. 3(C-4)，129 .9 (C-巧，113. 7 (C-6)，155. 8 (C-7)，115. 8 (C-的，157. 9 (C-9)，112. 7 (C-10)，80. 2 (C-2' )，62. l(C-3' )，73. l(C-4' )，21.4(C-5' )，26.9(C-6')。
[003引實(shí)施例2 :凱林內(nèi)醋對(duì)順銷致HK-2細(xì)胞腎損傷模型的保護(hù)作用
[0033] 1.材料與方法
[0034] 1. 1細(xì)胞人腎小管上皮細(xì)胞HK-2,購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、。
[0035] 1. 2主要試劑及儀器
[0036] 順銷購(gòu)自sigma公司；達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)液（Du化ecco'Sminimumessential medium,DMEM)/F12培養(yǎng)液、胎牛血清（fetalbovineserum,FB巧、膜蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；MIT購(gòu)自碧云天公司。
[0037] 1. 3HK-2細(xì)胞的培養(yǎng)
[0038]HK-2細(xì)胞在含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，5% 0)2, 37°C培養(yǎng)至 融合期的細(xì)胞用0. 25%膜酶消化，傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0039] 1. 4凱林內(nèi)醋對(duì)HK-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響：
[0040]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HK-2細(xì)胞，WIX104cells/100y1/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì) 胞生長(zhǎng)至80%W上，換為無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1化使處于同步狀態(tài)，分別加入6. 25,12. 5, 25， 50,100,150yg/ml各種濃度凱林內(nèi)醋于常規(guī)條件下培養(yǎng)，對(duì)照組：在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 24h后置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，每孔加入M1T溶液10y1，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼 續(xù)解育也吸棄上清，加入150iiIDMSO溶解甲瑣，使用酶標(biāo)儀W570nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，630皿 為參比波長(zhǎng)，讀取吸光度值，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，各組取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 1〇
[0041] 表1凱林內(nèi)醋對(duì)正常HK-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響0D值X±S
[0042]
[0043] 與正常組比較*:P< 0. 05
[0044] 由表1結(jié)果可知，凱林內(nèi)醋對(duì)正常HK-2細(xì)胞的生長(zhǎng)與對(duì)照組相比沒有明顯的影 響，安全性高。
[0045] 1. 5藥物保護(hù)作用
[0046] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HK-2細(xì)胞，W1X104cells/100y1/孔接種于96孔培養(yǎng)板 中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80 %W上，換為無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1化使處于同步狀態(tài)，分別加人 80ymol吃-1孤P，同時(shí)分別加入0,6. 25,12. 5, 25, 50,100,150yg/ml各種濃度凱林內(nèi)醋常 規(guī)條件培養(yǎng)，對(duì)照組：在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)，24h后置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化， 每孔加入M1T溶液10y1，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)解育地，吸棄上清，加入150y1 1DMS0溶 解甲瑣，使用酶標(biāo)儀W570nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，630nm為參比波長(zhǎng)，讀取吸光度值，每組設(shè)6個(gè)復(fù) 孔，各組取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。
[0047] 表2凱林內(nèi)醋對(duì)腎損傷細(xì)胞的保護(hù)作用
[0048]
陽(yáng)049] 與正常組比較##:P< 0. 01 ;與模型組比較* :p<0. 05 ;**:P< 0. 01
[0050] 由表2結(jié)果可知，模型組相比對(duì)照組具有顯著差異，表明順銷致HK-2細(xì)胞腎損傷 模型構(gòu)建成功。而在凱林內(nèi)醋藥物濃度為50、100yg/ml時(shí)，其對(duì)腎損傷細(xì)胞具有顯著的保 護(hù)作用，表明凱林內(nèi)醋能夠應(yīng)用于腎損傷保護(hù)藥物的制備中。
[0051] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，運(yùn)些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 凱林內(nèi)酯在制備腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述凱林內(nèi)酯包括順式凱林內(nèi)酯和/或反式 凱林內(nèi)酯。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述腎損傷為順鉑所致腎損傷。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述凱林內(nèi)酯從羌活中提取獲得。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，所述凱林內(nèi)酯由以下方法提取分離獲得： 步驟1、粉碎羌活根莖，加入乙醇溶液提取，提取液過(guò)濾、濃縮后加鹽酸調(diào)節(jié)pH為2,加 熱回流并濃縮蒸干獲得粗提物； 步驟2、粗提物加入乙醇溶液復(fù)溶，通過(guò)大孔樹脂柱吸附，依次水洗脫4個(gè)柱體積，40% 乙醇洗脫3個(gè)柱體積，60%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，收集60%乙醇洗脫液，除去溶劑，濃縮至浸 膏，然后加入乙酸乙酯溶解、過(guò)濾，濾液除去溶劑，濃縮、干燥，獲得羌活提取物； 步驟3、羌活提取物加甲醇溶解后，加入等量的粗硅膠中攪拌均勻，烘干后倒入到含 4~5倍量的200-300目硅膠柱中；石油醚平衡D-101柱子以后，利用石油醚-乙酸乙酯 50:1、20:1、10:1各洗脫4個(gè)柱體積，收集10:1洗脫部位濃縮蒸干，加甲醇溶解后，離心，取 上清液，利用高壓制備液相色譜進(jìn)行制備分離，獲得凱林內(nèi)酯。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，步驟1所述羌活根莖與乙醇溶液的體積 質(zhì)量比為lg:6-10mL。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述高壓制備液相色譜條件如下： 安捷倫1260型制備色譜儀，色譜柱為FujiC18(250X50mm);流動(dòng)相為乙腈-水；檢 測(cè)波長(zhǎng)為310nm;洗脫程序?yàn)?~60min，乙腈30%，水70% ;流速為30mL?minS柱溫為 30cC〇8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，步驟2所述粗提物加入乙醇溶液復(fù)溶為 粗提物加入羌活根莖總重1倍量的40%乙醇溶液溶解。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述大孔樹脂柱為D-101型大孔樹脂 柱。10. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述大孔樹脂柱重量為羌活根莖總重 的2倍。
【專利摘要】本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明公開凱林內(nèi)酯在保護(hù)腎損傷細(xì)胞中的應(yīng)用，從而為臨床上防止腎損傷提供多一種安全有效的用藥選擇。凱林內(nèi)酯在安全劑量?jī)?nèi)能夠有效地保護(hù)腎損傷細(xì)胞，可進(jìn)一步開發(fā)為腎損傷保護(hù)藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61P13/12, A61K31/35, C07D493/04
【公開號(hào)】CN105213364
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510770874
【發(fā)明人】蕭偉, 羅鑫, 王雪晶, 王紅梅, 趙祎武, 黃文哲, 王振中, 周習(xí)
【申請(qǐng)人】江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司
【公開日】2016年1月6日
【申請(qǐng)日】2015年11月12日