一種負載吲哚菁綠的自組裝多功能納米靶向系統的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥，特別是一種負載吲哚菁綠的自組裝多功能納米靶向系統的制備 方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 近年來，惡性腫瘤的發病率呈現上升趨勢。據有關數據顯示，我國居民惡性腫瘤死 亡率比70年代中期增加了 82. 3%。隨著社會經濟發展和人民生活水平提高，飲食結構改變 以及人口老齡化、城市化，慢性非傳染性疾病已經成為導致死亡的主要原因。其中，惡性腫 瘤是目前全世界的主要死亡原因之一，已經成為嚴重危害人類生命健康、制約社會經濟發 展的一大類疾病。
[0003] 阿霉素（Doxorubicin, D0X)是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，對 RNA的抑制作用最強，抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，如乳腺癌、肺癌、軟組織腫瘤、骨肉 瘤、膀胱癌等，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。目前已上 市的鹽酸阿霉素注射劑在臨床上使用時由于缺乏靶向性產生許多毒性反應，如心臟毒性、 抑制骨髓造血功能以及胃腸道反應等。
[0004] 羥基氯喹（Hydroxychloroquine, HCQ)是一種4-氨基喹啉衍生物類抗皰藥，主要 用于控制瘧疾臨床癥狀和瘧疾的抑制性預防。但有研究表明，羥基氯喹通過抑制腫瘤細胞 溶酶體功能而抑制自噬，自噬是細胞在各種應激下維持自身內環境穩態的代謝過程，許多 研究表明化療誘導的自噬對腫瘤具有保護作用，因而抑制自噬將逆轉腫瘤對化療的耐受， 具有抗腫瘤作用。因而羥基氯喹與化療藥物如阿霉素聯合可增加其對腫瘤細胞的毒性作 用。
[0005] 吲噪菁綠（Indocyanine Green, ICG)是一類近紅外染料，其作為近紅外焚光染料 在生命科學和生物醫學研究中具有重要的研究價值，是藥物研究中常用的熒光標記物。基 于它獨特的性質，吲哚菁綠是美國FDA批準的唯一的具有近紅外特性的光學診斷因子，同 時也是一種理想的光吸收劑用來進行激光介導的光熱治療。這種近紅外的染料可以作為一 種理想的對比劑來發展集光學成像和光熱治療于一體的雙功能靶向探針。
[0006] 但到目前為止，臨床上應用的給藥系統具有缺乏靶向性、半衰期短、給藥劑量大、 毒副作用大、功能單一的缺點。因此發明一種具有靶向性強、長循環、給藥量小、毒副作用 小、多功能的給藥系統是亟待解決的技術問題。
【發明內容】
[0007] 針對上述情況，為克服現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種負載吲哚菁 綠的自組裝多功能納米靶向系統的制備方法及其應用，可有效解決現有抗腫瘤藥物用于腫 瘤治療的靶向性差、毒副作用大、半衰期短、給藥劑量大、功能單一等問題。
[0008] 本發明解決的技術方案是，阿霉素（DOX)通過二硫鍵作為連接臂與羥基氯喹 (HCQ)相連形成自組裝納米粒，然后將吲哚菁綠（ICG)物理吸附到此納米粒中，再用磷脂 聚乙二醇葉酸（DSPE-PEG-FA)包裹納米粒形成負載吲哚菁綠的自組裝多功能納米靶向 系統，所述的二硫鍵為3, 3' -二硫代二丙酸或2, 2' -二硫代二乙酸，磷脂聚乙二醇葉酸 (DSPE-PEG-FA)的分子量為1~4kDa (即1000-4000道爾頓），具體步驟是：
[0009] (1)合成自組裝納米粒（DOX-S-S-HCQ):
[0010] ①取作為連接臂的3, 3' -二硫代二丙酸或2, 2' -二硫代二乙酸IOmg~Ig和二 氯亞砜I. 0~10.0 ml置于燒瓶中，加入15 y IN, N-二甲基甲酰胺（DMF)，85°C攪拌回流4h， 顏色由淺黃色變為橘黃色；用旋轉蒸發儀除去多余的二氯亞砜，再加入0. 5~5. OmlN，N-二 甲基甲酰胺（DMF)，得酰氯溶液；
[0011] ②取羥基氯喹0. 1~1.0 mmol溶于0. 5~5. Oml反應溶劑中，加入20~200 y 1 三乙胺，冰浴攪拌下滴加到酰氯溶液中，35~85°C油浴下反應2~8h，得酰氯化的羥基氯喹 溶液；
[0012] ③將0? 1~1.0 mmol阿霉素（DOX)溶于LO~5. Oml反應溶劑中，加入20~200 yl 三乙胺，冰浴攪拌下滴加入酰氯化的羥基氯喹溶液中，35~85°C油浴下攪拌3~12h，得反 應物，反應物用截留分子量1000的透析袋透析2天，透析液為超純水，每3小時換一次水， 冷凍干燥，得自組裝納米粒（DOX-S-S-HCQ);
[0013] 所述的反應溶劑為甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺與甲酰胺 的混合溶劑，或其它類似溶劑以及其它類似溶劑的混合物；
[0014] (2)自組裝納米粒負載吲哚菁綠（ICG/DOX-S-S-HCQ)的制備：
[0015] ①稱取0? 5~10.0 mg自組裝納米粒（DOX-S-S-HCQ)溶于0? 5~5. Oml二甲基亞 砜（DMSO)或乙醇中；
[0016] ②稱取吲哚菁綠（ICG)O. 1~5. Omg，溶于10~100mL超純水中，成吲哚菁綠溶液；
[0017] ③攪拌下將自組裝納米粒溶液滴加到吲哚菁綠溶液中，冰浴下探頭超聲5~ 30min，得包載吲噪菁綠（ICG)的自組裝納米粒；
[0018] (3)磷脂聚乙二醇葉酸（DSPE-PEG-FA)包裹負載吲哚菁綠的納米粒（ICG/ DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA)的制備：
[0019] 稱取磷脂聚乙二醇葉酸（DSPE-PEG-FA) 0? 1~5. Omg溶于濃度為1~8wt %的乙醇 水溶液2~IOml中，加熱到45~85°C至完全溶解，成磷脂聚乙二醇葉酸溶液；然后將包載 吲哚菁綠（ICG)的自組裝納米粒滴加到磷脂聚乙二醇葉酸溶液中，渦旋1~5min，室溫下攪 拌3~8h，將溶液用截留分子量3500的透析袋透析6~12h，每2小時換一次水，即得負載 吲哚菁綠的自組裝多功能納米靶向系統（ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA)。
[0020] 本發明制備的負載吲哚菁綠的自組裝多功能納米靶向系統（ICG/DOX-S-S-HCQ/ DSPE-PEG-FA)可有效用于對腫瘤的治療，實現在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0021] 本發明合成工藝簡單方便，具有良好的生物相容性、高靶向性、還原敏感性、低毒 性等優點，是腫瘤診斷治療用藥物制劑上的創新。
【具體實施方式】
[0022] 以下結合實施例對本發明的【具體實施方式】作詳細說明。
[0023] 實施例1
[0024] 本發明在具體實施中，可由以下步驟實現：
[0025] (1)合成自組裝納米粒（DOX-S-S-HCQ):
[0026] ①取作為連接臂的2, 2' -二硫代二乙酸54. 6mg和二氯亞砜I. 8ml置于圓底燒瓶 中，加入15 ylN，N-二甲基甲酰胺（DMF)，85°C攪拌回流4h，顏色由淺黃色變為橘黃色；用旋 轉蒸發儀除去多余的二氯亞砜，再加入1ml N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，得酰氯溶液；
[0027] ②取羥基氯喹0? 3mmol溶于0? 9mlN，N-二甲基甲酰胺（DMF)中，加入60 y 1三乙 胺，冰浴攪拌下滴加到酰氯溶液中，45°C油浴下反應8h，得酰氯化的羥基氯喹溶液；
[0028] ③將0? 3mmol阿霉素（DOX)溶于I. 8mlN，N-二甲基甲酰胺（DMF)中，加入60 y 1 三乙胺，冰浴攪拌下滴加入酰氯化的羥基氯喹溶液中，55°C油浴下攪拌8h，得反應物，反應 物用截留分子量1000的透析袋透析2天，透析液為超純水，每3小時換一次水，冷凍干燥， 得自組裝納米粒（DOX-S-S-HCQ);
[0029] (2)自組裝納米粒負載吲哚菁綠（ICG/D0X-S-S-HCQ)的制備：
[0030] ①稱取4mg自組裝納米粒（DOX-S-S-HCQ)溶于0? 6ml二甲基亞砜中；
[0031] ②稱取D引噪普綠0. 6mg，溶于12ml超純水中，成H引噪普綠溶液；
[0032] ③攪拌下將自組裝納米粒溶液滴加到吲哚菁綠溶液中，冰浴下探頭超聲20min，得 包載吲哚菁綠（ICG)的自組裝納米粒；
[0033] (3)磷脂聚乙二醇葉酸（DSPE-PEG-FA)包裹負載吲哚菁綠的納米粒（ICG/ DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA)的制備：
[0034] 稱取磷脂聚乙二醇葉酸0. 6mg溶于濃度為4wt %的乙醇水溶液3ml中，加熱到 55°C至完全溶解，成磷脂聚乙二醇葉酸溶液；然后將包載吲哚菁綠（ICG)的自組裝納米粒 滴加到磷脂聚乙二醇葉酸溶液中，渦旋3min，室溫下攪拌6h，將溶液用截留分子量3500的 透析袋透析6h，每2小時換一次水，即得負載吲哚菁綠的自組裝多功能納米靶向系統（ICG/ DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA)〇
[0035] 實施例2
[0036] 本發明在具體實施中，也可由以下步驟實現：
[0037] (1)合成自組裝納米粒（DOX-S-S-HCQ):
[0038] ①取作為連接臂的3, 3' -二硫代二丙酸84mg和二氯亞砜2. 4ml置于燒瓶中，加 入15 y I N，N-二甲基甲酰胺，85°C攪拌回流4h，顏色由淺黃色變為橘黃色；用旋轉蒸發儀 除去多余的二氯亞砜，再加入I. 5ml N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，得酰氯溶液；
[0039] ②取羥基氯喹0. 4mmol溶于I. 2ml N，N-二甲基甲酰胺（DMF)中，加入80 y 1三乙 胺，冰浴攪拌下滴加到酰氯溶液中，55°C油浴下反應6h，得酰氯化的羥基氯喹溶液；
[0040] ③將0? 4mmol阿霉素（DOX)溶于2. 4ml N，N-二甲基甲酰胺（DMF)中，加入80 y 1 三乙胺，冰浴攪拌下滴加入酰氯化的羥基氯喹溶液中，45°C油浴下攪拌10h，得反應物，反應