自體骨髓源性干細胞的快速輸注的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關申請
[0002] 本申請主張于2013年1月12日提交的美國臨時申請，申請序列號為61/751846 的優先權，所述申請公開的內容以引用方式全文明確地并入于此。
技術領域
[0003] 本發明涉及一種快速即時檢測（point-of-care)的方法和具有細胞群的組合物， 所述快速檢測方法用于對個體抽吸、分離、檢測和遞送預設劑量和粘度的獲取自骨髓的細 胞群及附帶的因子（accompanying factors);所述包含于組合物中的細胞群包括骨髓干細 胞和/或祖細胞、抗凝劑以及37°C測量時小于或等于5.0厘泊（cP)的粘度。
【背景技術】
[0004] 心血管疾病（CVD)是全球發病和死亡的首要原因。2008年，估計有1730萬人死 于CVD，占全球死亡總數的30%。在這些死者中，估計730萬人死于冠心病，620萬人死于 腦卒中。更值得注意的是，低收入和中等收入國家不相稱地被影響，推動對代替慢性藥物治 療方案的再生療法的需求，這種再生療法必需以消除對高成本實驗基礎設施或血管導管實 驗室廣泛多小時使用的需求的形式提供。超過80%的CVD死亡發生在低收入和中等收入國 家，在男性和女性中幾乎均等地發生。在CVD的病程中，動脈中發展出斑塊損傷，其導致血 管狹窄，并且在重癥患者中，所述斑塊病變脫落（break open)，在心臟、腦或肢體的重要部 位產生血流阻斷（缺血）。若短期內通過再灌注治療，以及進一步在有或沒有胞外因子的 存在下通過成體組織源性干細胞的輸注進行治療，這種缺血是可能被逆轉的。盡管醫學治 療以及血管重建策略已有重大進展，但是若在早期不引入生物修復干預，患有急性心肌梗 死（AMI)、慢性心力衰竭（CHF)、嚴重肢體缺血（CLI)和缺血性腦損傷（腦卒中）的特定患 者的預后仍會不良。
[0005] 與再灌注一起，輔助干細胞療法對缺血性損傷所造成的心臟、腦和肢體受損組織 的修復和再生已顯示出潛在有效性。可從不同來源分離出這些干/祖細胞，其中一個來 源是骨髓。自體的，骨髓源性為一種情況，外周血源性為第二種情況，脂肪源性為第三種情 況，這類成體干/祖細胞規避了與胚胎干細胞相關的道德和法律問題。此外，它也終止了 疾病傳播和免疫排斥的風險。自體干細胞（具體是脂肪或外周血，最具體是骨髓源性細胞 產品）的再生潛能受所采用的抽吸、處理和遞送技術的高度影響。抗凝劑在再生細胞治療 的整體功效中起到了非常重要的作用，且長時間暴露于抗凝劑中已顯示出對細胞的"干性 (sternness) "具有負面的影響。在抽吸注射器和處理裝置中使用抗凝劑讓骨髓保持在非凝 固態，使得干/祖細胞適當地分層、分離及輸注以治療臨床病癥。抗凝劑也在不同程度上抑 制微血栓（microthrombae)的形成，若其被注入患者體內可能導致不良事件。也能理解的 是在蛋白質或細胞（"生物制劑"）的存在下，任何化學個體的加入都可能對所述生物制劑 的結構或功能具有影響。因而，所用的抗凝劑、所用的濃度以及細胞暴露于抗凝劑中的時間 單獨地、潛在地、累計地對干細胞治療功效和安全性的整體效果起到至關重要的作用。理想 的干細胞相容的抗凝劑必須處于最優的濃度比率平衡，以在一段限定的時間內維持細胞治 療濃縮物或輸注物處于抗凝態，以完成介入步驟，并減少或消除血管內血栓的形成同時最 小化圍手術期出血和干細胞調控（modulation)的風險。
[0006] 肝素是骨髓抽吸中最常用的抗凝劑。但是已被報道肝素會干擾干細胞和/或祖細 胞的移動和歸巢機制（homing mechanism)，從而削弱這些細胞的功能治療能力。此外，肝素 與圍手術期出血的高發率有聯系，這可能與它們不能和連于凝塊上的凝血酶（clot-bound thrombin)結合相關。更進一步地，在體內通過將肝素與血小板因子-4(PF-4)結合，所述肝 素可被滅活。對肝素-PF-4復合物表達抗體的某些個體暴露于肝素時，會經歷肝素誘導的 血小板減小癥（HIT)。
[0007] 抗凝骨髓抽吸物處于異源混合物（包括造血干細胞（"HSC"）、間充質干細胞 (皿3〇、內皮祖細胞（1?(："）、0父0?4陽性細胞、白血球（"冊(："）、紅血球（"1?(："）、血小板 ("PLT"）、含血清蛋白和代謝物的血漿（"PLASMA"）和脂肪（"FAT"））中，且不適用于以 原始抽吸物形式直接遞送到患者的血管系統中。此外，為了可重現的病人到病人的治療功 效以便正確地限定治療細胞混合物的一致性（constituency)，以及為了制備治療細胞濃縮 物的安全的劑量特定體積（dose specific volume)，必須在短時間內從無效的和非預期的 細胞與脂肪中純化、分離或捕獲治療有效的細胞（HSC、MSC、WBC、EPC和CXCR4陽性細胞）， 以在即時檢測中產生濃縮的治療劑量的細胞及因子。
[0008] 細胞的純化，具體是包含所需HSC、EPC、MSC和其他干/祖細胞的WBC的純化，歷史 上通過如下方法完成：將所述細胞置于封閉裝置（containment device)中，并在重力下使 用基于化學密度的方法或基于自動的不含化學品的系統采用標準離心分層。在一段限定的 時間內，源自紅骨髓和間質的骨髓細胞在特定的重力（"g力"）下，將依據它們各自的密度 分層，從而自下而上在所述封閉裝置中產生細胞層，其中RBC(最稠密的）在底部，隨后是有 核的RBC和VSEL、WBC、PLT、PLASMA和FAT。兩種方法都簡單地獲得血沉棕黃層，其典型地 被限定為RBC/成核RBC部分之上和PLT部分之下的細胞層。
[0009] 理想的細胞純化流程包含閉合的最小化操控步驟（closed minimally manipulated procedure)，用于從不需要的成熟RBC中快速分層與分離所需的HSC、EPC、 MSC以及其他干/祖細胞，這些細胞在本文中也可被稱為干細胞或MNC或祖細胞或骨髓濃縮 物富集的祖細胞（BMCePC);并以PLASMA注滿所需細胞成分至出于安全考慮的合適的體積 和粘度，并通過干細胞友好的裝置（如整體交換（over the wire)球囊導管或器官內遞送 套管）有效地遞送至血管系統。
[0010] 通過導管操作遞送干細胞是向近端受累器官輸注細胞的理想方法。但是，經導管 傳輸的細胞在若干方面對所需細胞可能具有潛在的負面影響。首先，細胞承受變化的剪切 應力，這取決于它們與內腔壁接近度、注射速率、內腔半徑及流體的粘度；其次，由于內腔是 聚合物基質，其可潛在地影響細胞和細胞膜，其通過活化、結合或脫落而產生的接觸會是重 要的。
[0011] 經導管遞送干細胞至血管系統期望通過如下方法實現：在外周血管中引入血管內 導管，并通過充氣血管內囊，在一定預設時間內減緩或阻止血流，在導管尖的近端或末端的 目標器官中誘導暫時性缺血。這種缺血改善干和祖細胞到缺血組織的歸巢，并增加細胞引 發一個或多個過程的機會，所述過程包括但不限于：組織整合、細胞融合、細胞分化和/或 旁分泌因子釋放。通過對順應性或非順應性囊充氣以減少或阻止血流來最佳誘導缺血，同 時加倍注意從而最小化任何源自囊增壓的內皮壁損傷。
[0012] 因此，需要一種改善的方法和組合物，用于骨髓細胞的抽吸、處理和遞送，以使骨 髓源性干細胞為缺血性疾病的血管再生和/或器官修復提供安全和有效的輔助治療。
【發明內容】
[0013] 已開發出快速和有效的方法及完備的即時檢測試劑盒，其用于在短于90分鐘的 時間內對分離自骨髓的自體干細胞及因子的抽吸、處理和輸注。在一些實施方案中，用于骨 髓采集和處理的方法包括一定量或濃度的抗凝劑，優選是比伐盧定，其最小化凝塊形成的 時間達90分鐘，而不影響干細胞治療的功效。
[0014] 本發明所描述的一些實施方案產生了預期的包括干細胞和/或祖細胞的混合物， 所述混合物包含血沉棕黃層干細胞和/或祖細胞，如與取自骨髓的普通細胞群相比，具有 減少或降低量的紅細胞（RBC)的造血干細胞（HSC)、間充質干細胞（MSC)、內皮祖細胞（EPC) 和CXCR4陽性細胞。
[0015] 本發明所描述的一些實施方案提供了在即時檢測環境中的快速細胞輸注物分析， 保證了用于細胞治療的充足而有活力的劑量。
[0016] 本發明所描述的一些實施方案，在受控的粘度和流速下通過手動或計量機制輸注 細胞群，所述細胞群含有一定粘度下的骨髓源性干細胞和/或祖細胞，所述粘度在正常人 體溫度下測量（如：37°C時粘度為 5. 0cP、4. 5cP、4. 0cP、3. 5cP、3. 0cP、2. 5cP、2. 0cP、l. 5cP 或1.0 cP)，以確保有活力的和有效的細胞劑量可經導管注射被遞送，同時最小化剪切應力。
[0017] 本發明所描述的一些實施方案，經導管輸注上文所述的細胞群混合物，所述導管 包括適當和安全的囊充氣控制機制。
[0018] -些實施方案包含了除氯化鈉緩沖劑外作為唯一添加的化學品的抗凝劑。在一些 實施方案中所述抗凝劑是比伐盧定。與許多抗凝劑不同的是，比伐盧定產生很少溶血或不 產生溶血。
[0019] 本發明的實施方案也包括一次性離心細胞分層裝置，其可具有可控的閥門，能夠 對電機驅動的開關位置做出響應或可具有密度功能分離裝置，以可采集位于所述裝置之上 或之下的骨髓源性細胞群。一些實施方案包括了任選的裝載固件，用于控制多層區域特定 細胞群的問詢（interrogation)和采集，其通過光源透射值對預設光單元的響應不同或密 度等于目標細胞密度對質量比率的等密度分離裝置驅動，上述一些實施方案還包括用于核 實特定細胞群或細胞劑量和特定群粘度的快速分析儀器，以及血管內囊導管，其中對位于 目標器官近端的所述囊在規定時限內進行充氣，阻止80-100%的血流以誘發缺血。在一些 實施方案中，所采集的細胞和因子的受控最低細胞剪切輸注導致減輕程度的細胞凋亡或其 他細胞死亡，所述輸注經套管腔，以0. 5mL-2. 5mL每分鐘的速度由裝置進行控制或計量，所 述裝置例如是機械栗或可解釋為在線式手動壓力計的手動控制法。
[0020] 本公開通過引用進一步總結得到下述實施方案：
[0021] 1. 一種組合物，其包括：
[0022] (a)包含骨髓干細胞和/或祖細胞的第一細胞群，
[0023] (b)抗凝劑，以及
[0024] (c)緩沖水溶液和/或自體血清和/或自體血漿成分，
[0025] 其中所述組合物具有的粘度在37°C測量時不大于5. 0厘泊（cP)。
[0026] 2.實施方案1所述的組合物，其中含有骨髓干細胞和/或祖細胞的所述第一細胞 群是自體的。
[0027] 3.實施方案2所述的組合物，其中含有骨髓干細胞和/或祖細胞的所述第一細胞 群源自所述患者骨骼中的髓腔。
[0028] 4.實施方案3所述的組合物，其中所述骨骼是髂嵴、股骨、脛骨、脊柱、胸骨或肋 骨。
[0029] 5.實施方案3所述的組合物，其中包含骨髓干細胞的所述第一細胞群源自髂嵴腔 中的髓腔。
[0030] 6.實施方案1-5中任一項所述的組合物，其中所述抗凝劑選自由香豆素、維生 素 K拮抗劑、間接凝血酶抑制劑、肝素、因子Xa抑制劑、直接凝血酶抑制劑、巴曲酶、血紅素 (hemetin)、純化的植物提取物、EDTA、梓檬酸鹽、草酸鹽和硝基血紅素（nitrophorin)組成 的組。
[0031] 7.實施方案1-6中任一項所述的組合物，其中所述抗凝劑是直接凝血酶抑制劑。
[0032] 8.實施方案1-5中任一項所述的組合物，其中所述抗凝劑包含比伐盧定。
[0033] 9.實施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定提供自具有lmg/mL-50mg/mL的濃 度的儲備溶液。
[0034] 10.實施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定提供自具有5mg/mL-35mg/mL的 濃度的儲備溶液提供。
[0035] 11.實施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定提供自具有10mg/mL-25mg/mL的 濃度的儲備溶液提供。
[0036] 12.實施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定提供自具有18mg/mL-22mg/mL的 濃度的儲備溶液提供。
[0037] 13.實施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定提供自具有20mg/mL的濃度的儲 備溶液提供。
[0038] 14.實施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定以lmg/mL-3mg/mL的濃度存在于 所述組合物中。
[0039] 15.實施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定以I. 5mg/mL-2. 5mg/mL的濃度存 在于所述組合物中。
[0040] 16.實施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定以I. 8mg/mL-2. 2mg/mL的濃度存 在于所述組合物中。
[0041] 17.實施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定以2mg/mL的濃度存在于所述組 合物中。
[0042] 18.實施方案1-17中任一項所述的組合物，其中在37°C測量的所述粘度是 1.0 cP-5. OcP0
[0043] 19.實施方案1-17中任一項所述的組合物，其中在37°C測量的所述粘度為 I. 8cP-3. OcP0
[0044] 20.實施方案1-17中任一項所述的組合物，其中在37°C測量的所述粘度為 2. OcP-2. 5cP〇
[0045] 21.實施方案1-17中任一項所述的組合物，其中在37°C測量的所述粘度為 3. lcP-5. OcP0
[0046] 22.實施方案1-21中任一項所述的組合物，其中所述緩沖水溶液包含離子鹽。
[0047] 23.實施方案1-21中任一項所述的組合物，其中所述緩沖水溶液包含氯化鈉。
[0048] 24.實施方案1-21中任一項所述的組合物，其中所述緩沖水溶液包含氯化鈉，且 所述組合物中所述氯化鈉的量是0. 9%。
[0049] 25.實施方案1-24中任一項所述的組合物，其中包含骨髓細胞的所述細胞群包括 單核細胞，所述單核細胞包