48h進行定型處理，得到所需的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。
[0081]實施例4
[0082](I)制備真皮層皮片:將健康豬的整張腹部與背部皮用機械法進行初步脫脂，用鑷子把毛剔除干凈，用電動取皮機先將豬皮的皮下組織去掉，再去掉表皮0.2mm,制成厚度為0.8mm的真皮層皮片，儲存在-20°C環(huán)境中備用；
[0083](2)病毒滅活處理:將皮片經(jīng)過90°C干熱滅活24h ;
[0084](3)脫細(xì)胞處理:將步驟(2)制備的真皮層皮片用中性酶溶液處理12h，再用3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)處理8h，該步驟重復(fù)2次；
[0085](4)脫脂處理:一次脫脂是采用質(zhì)量濃度3%的碳酸鈉進行脫脂6h，皮片與脫脂劑的體積比為1:2 ;二次脫脂是將脫細(xì)胞真皮基質(zhì)置于有機溶劑正己烷、異丙醇中進行二次脫脂，正己烷處理時間為60min，異丙醇處理時間為50min，脫脂后的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)用磷酸緩沖鹽溶液清洗，清洗時間為4h，每隔20min換一次磷酸緩沖鹽溶液；
[0086](5)清洗及脫水處理:采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9 %的NaCl溶液和pH值為7.2的磷酸緩沖鹽溶液交替清洗，NaCl溶液處理時間為12h，磷酸緩沖鹽溶液處理時間為12h，NaCl溶液每隔Ih換液，交替清洗3次，最后采用洗衣機進行脫水處理；
[0087](6)凍干、定型處理:將經(jīng)清洗工藝后的皮片，放入特定程序的冷凍干燥機中凍干，將凍干后的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)置于20MPa的壓力下保壓5h，進行定型處理，得到所需的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。
[0088]實施例5
[0089](I)制備真皮層皮片:將健康豬的整張腹部與背部皮用機械法進行初步脫脂，用鑷子把毛剔除干凈，用電動取皮機先將豬皮的皮下組織去掉，再去掉表皮0.18mm,制成厚度為1.0mm的真皮層皮片，儲存在_20°C環(huán)境中備用；
[0090](2)脫脂處理:一次脫脂是采用質(zhì)量濃度1.2%的碳酸氫鈉進行脫脂12h，皮片與脫脂劑的體積比為1:3 ;二次脫脂是將皮片置于有機溶劑正己烷中進行二次脫脂，正己烷處理時間為30min ;脫脂后的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)真空干燥后用磷酸緩沖鹽溶液清洗，清洗時間為3h，每隔30min換一次磷酸緩沖鹽溶液；
[0091](3)脫細(xì)胞處理:將步驟(2)制備的真皮層用胃蛋白酶處理18h，再用烷基葡萄糖苷處理6h，SDS每隔Ih換液，該步驟重復(fù)3次；
[0092](4)病毒滅活處理:將脫細(xì)胞處理后的皮片用過氧乙酸-乙醇溶液進行病毒滅活，過氧乙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%，乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，皮片與病毒滅活溶液的體積比為1:3 ；
[0093](5)清洗及脫水處理:采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9 %的NaCl溶液和pH值為7.5的磷酸緩沖鹽溶液交替清洗，NaCl溶液處理時間為10h，磷酸緩沖鹽溶液處理時間為12h，每隔2h換液，交替清洗4次，最后采用機械力脫水設(shè)備進行脫水處理；
[0094](6)凍干、定型處理:將經(jīng)清洗及脫水后的皮片，放入冷凍干燥機進行凍干處理，再將凍干后的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)置于5MPa的壓力下保壓48h進行定型處理，得到所需的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。
[0095]以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1.一種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 對哺乳動物的皮膚進行預(yù)處理后得到真皮層皮片； 對所述真皮層皮片分別進行脫脂處理、病毒滅活處理和去除免疫原性處理，得到脫細(xì)胞真皮基質(zhì)前體，其中，所述脫脂處理、所述病毒滅活處理和所述去除免疫原性處理的操作順序可以相互更換，所述脫脂處理的操作為:將所述真皮層皮片依次浸泡在質(zhì)量百分含量為0.5%?3%的堿溶液及有機溶劑中進行脫脂，所述去除免疫原性處理的操作為:將所述真皮層皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性劑溶液中；以及 對所述脫細(xì)胞真皮基質(zhì)前體依次進行脫水、凍干和定型，得到脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述對哺乳動物的皮膚進行預(yù)處理后得到真皮層皮片的操作為:用機械法對所述哺乳動物的皮膚進行初步脫脂及除毛，接著用取皮機將所述哺乳動物的皮膚去掉0.15_?0.4_表皮與皮下組織后制成厚度為0.3mm?1.0mm的真皮層皮片。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述哺乳動物的皮膚包括依次層疊的皮毛、表皮層、真皮層和皮下組織。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述哺乳動物的皮膚為豬、牛、羊或馬的皮膚。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述將所述真皮層皮片依次浸泡在質(zhì)量百分含量為0.5%?3%的堿溶液及有機溶劑中進行脫脂的操作中，所述真皮層皮片與所述堿溶液的體積比為1:1?4，所述堿溶液的溶質(zhì)選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉和氫氧化鉀中的一種，所述真皮層皮片浸泡在所述堿溶液中的時間為6h ?24h ; 所述將所述真皮層皮片依次浸泡在質(zhì)量百分含量為0.5%?3%的堿溶液及有機溶劑中進行脫脂的操作中，所述真皮層皮片與所述有機溶劑的體積比為1:1?4，所述有機溶劑選自丙酮、乙醇、正己烷和異丙醇中的一種或兩種，所述真皮層皮片浸泡在所述有機溶劑中的操作重復(fù)I次?8次，所述真皮層皮片每次浸泡在所述有機溶劑中的時間為15min?60mino6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述病毒滅活處理的操作為:按照體積比為1:1?4，將所述真皮層皮片浸泡在病毒滅活溶液處0.5h?Sh進行病毒滅活處理，所述病毒滅活溶液為過氧化物和乙醇的混合溶液或過氧化物溶液，所述過氧化物和乙醇的混合溶液中的過氧化物的質(zhì)量百分含量為0.1 %?10%，所述過氧化物和乙醇的混合溶液中的乙醇的質(zhì)量百分含量為20%?70%。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述病毒滅活處理的操作為:對所述真皮層皮片在50°C?120°C下進行干熱滅活處理3h?48h。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述將所述真皮層皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性劑溶液中操作中，所述蛋白酶溶液的溶質(zhì)為胰蛋白酶、胃蛋白酶或中性蛋白酶，所述蛋白酶溶液的溶質(zhì)的質(zhì)量百分含量為0.05%?0.5%，所述表面活性劑溶液的溶質(zhì)選自烷基葡萄糖苷、十二烷基硫酸鈉、TritonX-100、脫氧膽酸鈉、3-[ (3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、硫代甜菜-10和硫代甜菜-16中的一種，所述表面活性劑溶液的溶質(zhì)的質(zhì)量百分含量為0.01%?5%，所述交替浸泡的次數(shù)為2次?6次，所述交替浸泡的操作中每次操作的時間為6h?24h。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述對所述脫細(xì)胞真皮基質(zhì)前體依次進行脫水、凍干和定型的操作為:將所述脫細(xì)胞真皮基質(zhì)前體脫水后放入冷凍干燥機凍干，接著置于5MPa?30MPa的壓力下保壓Ih?30h進行定型處理。10.一種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，其特征在于，所述脫細(xì)胞真皮基質(zhì)采用如權(quán)利要求1?9中任一項所述的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法制備得到。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)及其制備方法，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法包括如下步驟：對哺乳動物的皮膚進行預(yù)處理后得到真皮層皮片；對真皮層皮片分別進行脫脂處理、病毒滅活處理和去除免疫原性處理，得到脫細(xì)胞真皮基質(zhì)前體，去除免疫原性處理的操作為：將真皮層皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性劑溶液中；以及對脫細(xì)胞真皮基質(zhì)前體依次進行脫水、凍干和定型，得到脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。這種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法通過將真皮層皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性劑溶液中可以最大限度的降低真皮基質(zhì)的免疫原性，又保留了真皮基質(zhì)的正常膠原結(jié)構(gòu)，制得的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)具有適當(dāng)?shù)慕到馑俾?、良好的生物相容性與骨誘導(dǎo)能力。
【IPC分類】A61L27/36, A61L27/60
【公開號】CN105126170
【申請?zhí)枴緾N201510508880
【發(fā)明人】李麗花, 鐘梅玲, 譚榮偉, 佘振定
【申請人】深圳蘭度生物材料有限公司
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年8月18日