脫細胞真皮基質及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫療材料領域，特別是涉及一種脫細胞真皮基質及其制備方法。
【背景技術】
[0002]自體皮和異體皮的來源極為有限，異種(如:豬、牛等)脫細胞真皮就成為了當今軟組織修復技術研究的一大主題。而真皮組織在修復過程中很容易出現一系列的免疫排斥反應，主要來自于細胞和脂肪。脫細胞真皮基質的制備方法有很多種，目的是能夠去除真皮內所有的細胞成分而最大限度保留真皮內膠原結構等的完整性。
[0003]現有的專利公開了各種脫細胞真皮基質的制備方法，例如公開號為CN104288837A的專利申請公開了一種單純利用堿液對超薄乳頭層皮膚進行脫細胞的方法，但該真皮基質脫細胞方法的適用范圍及應用都非常有限；公開號為CN1775189的專利申請采用哺乳動物皮膚用氫氧化鈉溶液反復處理，去除組織中細胞遺傳物質DNA，再用去污劑去除細胞膜中的脂類物質，但是不能有效去除細胞碎肩成分；公開號為CN201350162Y的專利公開了一種脫細胞異體真皮基質組織補片，但對其制備方法未做詳述。
[0004]因此針對現有技術的不足，提供一種既能夠降低真皮基質的免疫原性，又保留了真皮基質的正常膠原結構的脫細胞真皮基質及其制備方法。
【發明內容】
[0005]基于此，有必要提供一種大小、形狀容易控制的脫細胞真皮基質及其制備方法。
[0006]—種脫細胞真皮基質的制備方法，包括如下步驟:
[0007]對哺乳動物的皮膚進行預處理后得到真皮層皮片；
[0008]對所述真皮層皮片分別進行脫脂處理、病毒滅活處理和去除免疫原性處理，得到脫細胞真皮基質前體，其中，所述脫脂處理、所述病毒滅活處理和所述去除免疫原性處理的操作順序可以相互更換，所述脫脂處理的操作為:將所述真皮層皮片依次浸泡在質量百分含量為0.5%?3%的堿溶液及有機溶劑中進行脫脂，所述去除免疫原性處理的操作為:將所述真皮層皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性劑溶液中；以及
[0009]對所述脫細胞真皮基質前體依次進行脫水、凍干和定型，得到脫細胞真皮基質。
[0010]在一個實施例中，所述對哺乳動物的皮膚進行預處理后得到真皮層皮片的操作為:用機械法對所述哺乳動物的皮膚進行初步脫脂及除毛，接著用取皮機將所述哺乳動物的皮膚去掉0.15mm?0.4mm表皮與皮下組織后制成厚度為0.3mm?1.0mm的真皮層皮片。
[0011]在一個實施例中，所述哺乳動物的皮膚包括依次層疊的皮毛、表皮層、真皮層和皮下組織。
[0012]在一個實施例中，所述哺乳動物的皮膚為豬、牛、羊或馬的皮膚。
[0013]在一個實施例中，所述將所述真皮層皮片依次浸泡在質量百分含量為0.5%?3%的堿溶液及有機溶劑中進行脫脂的操作中，所述真皮層皮片與所述堿溶液的體積比為I:1?4，所述堿溶液的溶質選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉和氫氧化鉀中的一種，所述真皮層皮片浸泡在所述堿溶液中的時間為6h?24h ；
[0014]所述將所述真皮層皮片依次浸泡在質量百分含量為0.5%?3%的堿溶液及有機溶劑中進行脫脂的操作中，所述真皮層皮片與所述有機溶劑的體積比為1:1?4，所述有機溶劑選自丙酮、乙醇、正己烷和異丙醇中的一種或兩種，所述真皮層皮片浸泡在所述有機溶劑中的操作重復I次?8次，所述真皮層皮片每次浸泡在所述有機溶劑中的時間為15min ?60mino
[0015]在一個實施例中，所述病毒滅活處理的操作為:按照體積比為1:1?4，將所述真皮層皮片浸泡在病毒滅活溶液處0.5h?Sh進行病毒滅活處理，所述病毒滅活溶液為過氧化物和乙醇的混合溶液或過氧化物溶液，所述過氧化物和乙醇的混合溶液中的過氧化物的質量百分含量為0.1%?10%，所述過氧化物和乙醇的混合溶液中的乙醇的質量百分含量為 20%?70%。
[0016]在一個實施例中，所述病毒滅活處理的操作為:對所述真皮層皮片在50°C?120°C下進行干熱滅活處理3h?48h。
[0017]在一個實施例中，所述將所述真皮層皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性劑溶液中操作中，所述蛋白酶溶液的溶質為胰蛋白酶、胃蛋白酶或中性蛋白酶，所述蛋白酶溶液的溶質的質量百分含量為0.05%?0.5%，所述表面活性劑溶液的溶質選自烷基葡萄糖苷、十二烷基硫酸鈉、TritonX-100、脫氧膽酸鈉、3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]_1_丙磺酸、硫代甜菜-10和硫代甜菜-16中的一種，所述表面活性劑溶液的溶質的質量百分含量為0.01%?5%，所述交替浸泡的次數為2次?6次，所述交替浸泡的操作中每次操作的時間為6h?24h0
[0018]在一個實施例中，所述對所述脫細胞真皮基質前體依次進行脫水、凍干和定型的操作為:將所述脫細胞真皮基質前體脫水后放入冷凍干燥機凍干，接著置于5MPa?30MPa的壓力下保壓Ih?30h進行定型處理。
[0019]—種脫細胞真皮基質，所述脫細胞真皮基質采用如上述的脫細胞真皮基質的制備方法制備得到。
[0020]這種脫細胞真皮基質的制備方法通過對真皮層皮片進行脫脂處理、病毒滅活處理和去除免疫原性處理，將真皮層皮片交替浸泡在蛋白酶溶液和表面活性劑溶液中可以最大限度的降低真皮基質的免疫原性，又保留了真皮基質的正常膠原結構，制得的脫細胞真皮基質具有適當的降解速率、良好的生物相容性與骨誘導能力。
【附圖說明】
[0021]圖1為一實施方式的脫細胞真皮基質的制備方法的流程圖；
[0022]圖2是實施例1制得的制備脫細胞真皮基質的光滑面的掃描電子顯微鏡照片；
[0023]圖3是實施例1制得的制備脫細胞真皮基質的粗糙面的掃描電子顯微鏡照片；
[0024]圖4是實施例1制得的制備脫細胞真皮基質的截面的掃描電子顯微鏡照片；
[0025]圖5是實施例1制得的制備脫細胞真皮基質經過蘇木精-伊紅染色后的倒置顯微鏡照片。
【具體實施方式】
[0026]下面主要結合附圖及具體實施例對脫細胞真皮基質及其制備方法作進一步詳細的說明。
[0027]如圖1所示的脫細胞真皮基質的制備方法，包括如下步驟:
[0028]S10、對哺乳動物的皮膚進行預處理后得到真皮層皮片。
[0029]對哺乳動物的皮膚進行預處理后得到真皮層皮片的操作為:用機械法對哺乳動物的皮膚進行初步脫脂及除毛，接著用取皮機將哺乳動物的皮膚去掉0.15mm?0.4mm表皮與皮下組織后制成厚度為0.3mm?1.0mm的真皮層皮片。
[0030]哺乳動物的皮膚包括依次層疊的皮毛、表皮層、真皮層和皮下組織。
[0031 ] 具體的，哺乳動物的皮膚為豬、牛、羊或馬的皮膚。
[0032]得到的真皮層皮片可以低溫儲存備用。具體的，得到的真皮層皮片可以儲存在-20°C下備用。
[0033]S20、對SlO得到的真皮層皮片分別進行脫脂處理、病毒滅活處理和去除免疫原性處理，得到脫細胞真皮基質前體。
[0034]需要說明的是，脫脂處理、病毒滅活處理和去除免疫原性處理的操作順序可以相互更換。
[0035]S20中，脫脂處理的操作具體為:將真皮層皮片依次浸泡在質量百分含量為0.5%?3%的堿溶液及有機溶劑中進行脫脂。
[0036]將真皮層皮片依次浸泡在質量百分含量為0.5%?3%的堿溶液中的操作中，真皮層皮片與堿溶液的體積比為1:1?4，堿溶液的溶質選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉和氫氧化鉀中的一種，真皮層皮片浸泡在堿溶液中的時間為6h?24h。
[0037]優選的，真皮層皮片與堿溶液的體積比為1:3，堿溶液的溶質為氫氧化鈉，堿溶液的溶質的質量百分含量為2%，真皮層皮片浸泡在堿溶液中的時間為8h。
[0038]將真皮層皮片依次浸泡在有機溶劑中的操作中，真皮層皮片與有機溶劑的體積比為1:1?4，有機溶劑選自丙酮、乙醇、正己烷和異丙醇中的一種或兩種，二次脫脂的操作重復I次?8次，真皮層皮片每次浸泡在有機溶劑中的時間為15min?60min。
[0039]優選的，真皮層皮片與有機溶劑的體積比為1:3，有機溶劑為乙醇和異丙醇的混合溶液，二次脫脂的操作重復2次，真皮層皮片每次浸泡在有機溶劑中的時間為60min。
[0040]得到的脫脂后的真皮層皮片采用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈后備用。
[0041]S20中，病毒滅活處理的操作可以為:按照體積比為1:1?