凍干的或可凍干形式的lkktet和/或lkktnt肽組合物的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請號為200680021662. 0,申請日為2006年6月19日，發明名稱為"凍 干的或可凍干形式的LKKTET和/或LKKTNT肽組合物"的中國專利申請的分案申請。
[0002] 發明背景
[0003] 相關申請的交叉引用
[0004] 本發明要求2005年6月17日提交的美國臨時申請60/691，261和2006年2月28 日提交的美國臨時申請60/776, 947的權益。
技術領域
[0005] 本發明涉及LKKTET和/或LKKTNT組合物及方法的領域。
【背景技術】
[0006] 胸腺素e 4起初被認為是在體外內皮細胞迀移和分化期間被上調的蛋白。胸腺素 0 4最初從胸腺分離，是一個具有43個氨基酸、4. 9KDa、在多種組織中普遍存在的多肽。歸 于該蛋白的幾種功能包括在內皮細胞分化和迀移、T細胞分化、肌動蛋白隔離、血管形成和 傷口愈合中的功能。
[0007] 已經鑒定了許多T0 4異構體，其與已知的T0 4氨基酸序列具有約70%、或約 75 %、或約80 %或更高的同源性。這些異構體包括，例如T 0 4ala、T 09、T01O、T011、T012、 Tf3 13、Tf3 14和Tf3 15。與Tf3 4相似，Tf3 10和Tf3 15異構體也表現出能隔離肌動蛋白的 活性。T 4、T 10和T 15,以及這些其他異構體共有一個氨基酸序列LKKTET或LKKTNT， 其似乎參與調節肌動蛋白的隔離或結合。盡管不希望被任何特定的理論所限制，但本文中 描述的肽試劑的活性至少部分地歸因于這些試劑的抗炎活性。0 _胸腺素也調節了肌動蛋 白聚合（例如，0胸腺素似乎通過隔離游離的G-肌動蛋白而解聚F-肌動蛋白）。T 0 4調 節肌動蛋白聚合的能力可歸因于其通過LKKTET序列結合或隔離肌動蛋白的能力。
[0008] 本領域需要LKKTET和/或LKKTNT的組合物和方法。
【發明內容】
[0009] 根據一個【具體實施方式】，組合物包括含氨基酸序列LKKTET或LKKTNT或其保守變 異體的肽試劑，或者包括刺激LKKTET或LKKTNT肽或其保守變異體產生的刺激試劑，該組合 物包括至少一種氨酸穩定劑，該組合物是凍干的形式或能夠被凍干的形式。
[0010] 根據另一【具體實施方式】，組合物包括含氨基酸序列LKKTET或LKKTNT或其保守變 異體的肽試劑，或者刺激LKKTET或LKKTNT肽或其保守變異體產生的刺激試劑，以及包括凍 干填充劑或氨基酸穩定劑中的至少一種，所述組合物是凍干的形式。
【具體實施方式】
[0011] 為多種目的而對受試者施用的許多組合物含有一種或多種可能導致受試者損傷 的組分。
[0012]例如，防腐劑，如用在許多眼用和化妝產品的苯扎氯銨（BAK)，在施用該產品時可 引起表面刺激和/或傷害。綜合癥包括發紅和不適。
[0013] 長期使用含有季銨鹽（如BAK)的滴眼液會產生顯著且逐漸嚴重的眼睛表面刺激 和細胞凋亡。患者經常發展為諸如發紅和通常的眼部不適這樣的癥狀。本發明的肽試劑， 例如胸腺素0 4 (T 0 4)，在與季銨鹽（如BAK) -起接觸眼組織對受試者施用時，可用于治療 或阻止對眼組織的傷害或受損。
[0014] 可以用于本發明的季銨鹽的實例包括BAK、西曲溴銨（cetrimide)、苯佐氯銨 (benzoxonium)及其類似物。
[0015] 根據【具體實施方式】，該肽試劑與作為同一個制劑一部分的銨鹽如BAK -起施用， 例如作為添加劑加入到含BAK或其他季銨鹽的制劑中。季銨鹽如BAK在許多眼溶液，如青 光眼滴眼液中常用作防腐劑。
[0016] 在另一個【具體實施方式】中，該肽試劑可在施用季銨鹽如BAK之前，和/或施用季銨 鹽如BAK期間，和/或施用季銨鹽如BAK之后施用。
[0017] 根據【具體實施方式】，本發明尤其可用于阻止對眼角膜上皮的眼組織的傷害，其包 括阻止這類眼組織中的細胞凋亡。例如，本發明也用作抗青光滴眼液或其他滴眼液的佐劑。
[0018] 本發明一方面提供了眼用組合物，其包括含氨基酸序列LKKTET或LKKTNT的肽試 劑或其保守變異體。
[0019] 本發明另一方面提供了治療眼組織的方法，其包括對所述眼組織局部施用眼用組 合物，該組合物包括氨基酸序列LKKTET或LKKTNT的肽試劑或其保守變異體
[0020] 在【具體實施方式】中，本發明提供了通過將眼組織與有效量的含本文描述的肽試劑 的組合物接觸的治療方法。直接施用的實施例包括，例如直接應用含本文描述的肽制劑的 溶液、洗劑、油膏、凝膠、乳膏、糊劑、噴霧劑、懸浮液、分散液、水凝膠、軟膏、油或泡沫與組織 接觸。
[0021] 未發現適于任何特定理論，肌動蛋白-隔離肽，如胸腺素P4(T04或TB4)和其他 包括肌動蛋白-隔離肽或肽片段的試劑可以促進眼組織健康，其中肌動蛋白-隔離肽或肽 片段含氨基酸序列LKKTET或LKKTNT或其保守變異體。
[0022] 胸腺素0 4起初被認為是內皮細胞迀移和體外分化期間被上調的蛋白。胸腺素 0 4最初從胸腺分離，是一個具有43個氨基酸、4. 9Kda、在多種組織中普遍存在的多肽。歸 于該蛋白的幾種功能包括在內皮細胞分化和迀移、T細胞分化、肌動蛋白隔離、血管形成和 傷口愈合中的功能。
[0023] 根據【具體實施方式】，本發明優選地適用于胸腺素0 4、和/或TP 4異構體、類似物 或衍生物，其中包括KLKKTET、LKKTETQ、氧化的T 0 4、T 0 4亞砜、T 0 4的N-端變異體和C-端 變異體。
[0024] 根據【具體實施方式】，可用于本發明的組合物包括肽試劑，例如胸腺素0 4、和/或 T 0 4異構體、類似物或衍生物，其中包括T 0 4的氧化形式（包括T 0 4亞砜）、T 0 4的N-端 變異體和C-端變異體、以及包含或基本上由氨基酸序列LKKTET及其保守性變異體組成的 多肽或肽片段。國際申請PCT/US99/17282公開了可用于本發明的TP 4的異構體，以及可 用于本發明的氨基酸序列LKKTET或LKKTNT和其保守變異體，該申請通過引用的方式納入 本文。國際申請PCT/GB99/00833(W099/49883)公開了可用于本發明的氧化的胸腺素0 4， 該申請通過引用的方式納入本文。盡管本發明在下文中主要針對T 0 4和T 0 4異構體進 行描述，但應當理解為以下描述同樣適用于氨基酸序列LKKTET或LKKTNT、包含或基本上由 LKKTET、LKKTNT組成的肽和片段、它們的保守變異體，和/或T 0 4異構體、類似物或衍生物， 其中包括氧化的T 0 4、T 0 4的N-端變異體和C-端變異體。
[0025] 根據【具體實施方式】，本發明的組合物以每天、每兩天、每兩周、每兩個月等的頻率 施用，其中在施用的每日，可進行單次或多次用藥，例如每施用當日用藥2、3、4或更多次。
[0026] 已經鑒定了許多T0 4異構體，其與已知的T0 4氨基酸序列具有約70%、或約 75 %、或約80 %或更高的同源性。這些異構體包括，例如T 0 4ala、T 09、T01O、T011、T012、 Tf3 13、Tf3 14和Tf3 15。與Tf3 4相似，異構體Tf3 10和Tf3 15也表現出能隔離肌動蛋白的 活性。T 4、T 10和T 15,以及其他異構體共有氨基酸序列LKKTET或LKKTNT，其似乎參 與調節肌動蛋白的隔離或結合。T 0 4具有抗炎活性，并且也能調節肌動蛋白聚合（例如，0 胸腺素似乎通過隔離游離的G-肌動蛋白而解聚F-肌動蛋白）。TP 4調節肌動蛋白聚合的 能力可歸因于其通過LKKTET或LKKTNT序列結合或隔離肌動蛋白的能力。這樣，與T 0 4 - 樣，其他抗炎性蛋白和/或結合或隔離肌動蛋白，或者調節肌動蛋白聚合的蛋白（其中包括 具有氨基酸序列LKKTET的T 0 4異構體）很可能如本文說明的那樣單獨或與T 0 4組合而 發揮作用。
[0027] 因此，可以明確預期已知的T0 4異構體，例如TP 4ala、T0 9、T0 10、TP 11、T0 12、 Tf3 13、TM4和Tf3 15,以及還未鑒定的Tf3 4異構體可用于本發明的方法。這樣，Tf3 4異 構體可用于本發明的方法，其中包括在受試者中采用的方法。本發明從而進一步提供了包 括1'0 4，以及1'0 4異構體1'0 4-、1'0 9、1'0 1〇、1'0 11、1'0 12、1'0 13、1'0 14和1'0 15，以及 眼用載體的藥物組合物。
[0028] 另外，如在適當的隔離、結合、動員或聚合分析中所顯示的那樣或如通過具有調節 肌動蛋白結合的氨基酸序列（例如LKKTETR、LKKTNT)所確認的那樣，其他具有抗炎活性和 /或肌動蛋白隔離或結合能力，或能夠動員肌動蛋白或調節肌動蛋白聚合的試劑或蛋白質， 可相似地用于本發明的方法。這樣的蛋白包括例如凝溶膠蛋白、維生素D結合蛋白（DBP)、 抑制蛋白（profilin)、cofilin、蠶食蛋白（depactin)、DNA酶I、絨毛蛋白（villin)、截斷 蛋白（fragmin)、肌割蛋白（severin)、加帽蛋白（capping protein)、肌動蛋白和肌動 調解蛋白（acumentin)。因此，方法包括已用于受試者的那些方法。本發明進一步提供了藥 物組合物，其包括本文提到的凝溶膠蛋白、維生素D結合蛋白（DBP)、抑制蛋白（profilin)、 cofilin、蠶食蛋白（depactin)、DNA酶I、絨毛蛋白（villin)、截斷蛋白（fragmin)、肌割蛋 白（severin)、加帽蛋白（capping protein)、肌動蛋白和肌動調解蛋白（acumentin)。 因此，本發明包括含有氨基酸序列LKKTET、或LKKTNT和其保守變異體的多肽的應用。
[0029] 本文所使用的術語"保守變異體"或其語法上的變體是指氨基酸殘基被另一種生 物學上相似的殘基替換。保守變異體的實例包括疏水殘基例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或 甲硫氨酸替換另一個疏水性殘基，極性殘基替換另一個極性殘基，例如用精氨酸替換賴氨 酸、谷氨酸替換天門冬氨酸、或谷氨酰胺替換天門冬酰胺以及類似的替換。
[0030] 根據【具體實施方式】，本發明的組合物是滴眼液制劑。
[0031] 根據【具體實施方式】，用于本發明的組合物包含本文所描述的肽試劑，其中肽試劑 的濃度范圍是大約〇. 001-1000毫克每毫升（mcg/ml)，更優選的是0. l-100mcg/ml，最優選 的是大約l-l〇mcg/ml。在特別優選的【具體實施方式】中，該肽試劑是T0 4。
[0032] 根據【具體實施方式】，本發明用于治療或預防眼組織由于與季銨鹽如BAK接 觸造成的損害或損傷，季銨鹽濃度范圍是大約0. 0001 -1w t %，優選的濃度范圍是大約 0. 001-0. lwt %，更優選的濃度范圍是0. 002-0. 05wt %。在一個【具體實施方式】中，季銨鹽的 濃度是大約〇? 005-0. 02wt%。
[0033] 根據【具體實施方式】，本發明也包括含本文中所描述的肽試劑的藥物組合物，該肽 試劑在可眼用載體中。這樣的載體包括，例如本文中所列的載體。
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