注射10% 蛋清0.lml致炎。在致炎后1，2, 3, 4h分別測定大鼠左后足厚度，計算各大鼠致炎前后左后 足厚度變化，以腫脹度（致炎后足厚度值與致炎前足厚度之差值）判定藥物的抗炎效果。結 果見表2。
[0062] 2. 4 結果
[0063] 表2 :塞隆骨提取物給藥對蛋清致大鼠足腫脹的影響
[0064]
[0065] *P〈0. 05 ;**p〈0.Olvsmodel
[0066] SLG-e在抑制蛋清致的大鼠足腫脹實驗中表現出了一定的抗炎效果，能夠抑制由 蛋清引起的大鼠足腫脹，但均未產生明顯的抑制效果（P>〇. 05)。
[0067] 3.SLG-e對二硝基氟苯誘導的DTH小鼠耳腫脹的影響
[0068] 3. 1實驗動物：SPF級BALB/c小鼠，雌性，6-8周齡，體重20 - 25g，分為6組，分別 為四個給藥組，模型組及一個陽性對照組，每組10只。購自中國科學院上海實驗動物中心。
[0069] 3. 2受試藥物及實驗材料：SLG-e;0. 5%DNFB(取適量DNFB溶于丙酮：橄欖油=4 : 1的溶劑中）。
[0070] 3. 3實驗方法：
[0071] 1.致敏：將0. 5%的DNFB溶液用槍緩慢加到BALB/C雌鼠的后腳上致敏（每只后 腳20ul)。次日加強一次。
[0072] 2.初次致敏后第9天，用20ul0. 4%DNFB攻擊鼠左耳，內外兩側各10ul。
[0073] 3.攻擊前lh給藥；攻擊后12h腹腔注射給藥（可根據實際情況確定給藥方案）
[0074]4.攻擊后24~48h檢測各指標。
[0075] 注：①若BALB/C用20ul/只腳使腳腫，可改用15ul/只腳。致敏時，讓致敏劑干后 再將小鼠放回籠中。加強后分籠。
[0076] ②ICR鼠致敏和加強用20ul0? 7% ;攻擊用20ul0? 6%DNFB
[0077] ③處理小鼠前，將實驗室室溫調至24°C左右。攻擊后，讓耳部油劑晾干后放回籠 中。
[0078] ④在室溫為24°C時，將小鼠提前取出；在實驗室先放一段時間，讓其恢復原先狀 〇
[0079] ⑤處理小鼠時，脫頸椎處死一打耳片一稱重
[0080] 3. 4結果與討論：
[0081] 表3 :提取物SLG-e對DNFB誘導的BALB/c耳腫脹的抑制效果
[0082]
[0083] n = 10*P〈0. 05, **P〈0.OlvsModel
[0084] DTH實驗是一種體內檢測細胞介導免疫功能的方法，與接觸性超敏反應相似。DTH 也包括致敏和觸發兩個階段。致敏約需要6天，在觸發后的24~48小時DTH的炎癥反應 達到高峰。在初始的致敏階段有記憶性的抗原特異性細胞分布到外周各淋巴組織，在任何 局部的抗原刺激會使這些細胞迅速活化引起DTH。
[0085] 4.SLG-e對T/B淋巴細胞增殖的影響
[0086] 4. 1試驗目的：
[0087] 本試驗采用MTT法在體外檢測塞隆骨制劑及不同提取物對小鼠脾臟淋巴細 胞的細胞毒性。利用絲裂原ConA，LPS分別誘導小鼠脾臟T，B淋巴細胞增殖，通過 [3H]-thymidine摻入法，觀察評價塞隆提取物在體外對正常小鼠淋巴細胞增殖活性的影 響。
[0088] 4. 2受試藥物：
[0089] 名稱：塞隆骨提取物SLG-e。
[0090] 配制方法：_20°C保存備用；試驗前用DMS0溶解，稀釋至所需濃度后使用。
[0091] 4. 3試驗動物及實驗材料：
[0092] SPF級BALB/c小鼠，雌性，6-8周齡，購自中國科學院上海實驗動物中心。
[0093]MTT，ConA，LPS :Sigma公司產品。
[0094] 胎牛血清（FBS) :Invitrogen公司產品。
[0095] 3H_胸腺啼啶核苷酸（[3H]-thymidine):購買于上海原子核研究所。
[0096] 4. 4試驗原理：
[0097]刀豆素（ConA)、細菌脂多糖（LPS)是常用的有絲分裂原，在體外可分別誘導正常 小鼠脾臟淋巴T細胞、B細胞增殖。淋巴細胞激活后進入細胞周期有絲分裂，細胞合成DNA 量明顯增加，在培養基中加入3H標記的DNA前身物質胸腺啼啶核苷（thymidine)，可摻入到 新合成的DNA中。根據[3H]-thymidine的摻入量可推測淋巴細胞對絲裂原的應答水平。摻 入的[3H]-thymidine經液體閃爍測量法測出，以cpm加以計算，了解受試藥物對細胞增殖 活性的影響。
[0098] 4. 5試驗方法：
[0099] 脾細胞懸液制備：取實驗小鼠脫脊椎法處死，消毒取脾臟。將脾臟用玻片磨碎過膜 于1200rpm離心5分鐘棄去上清。沉淀加紅細胞裂解液2-4ml混勻，靜置1分鐘，加PBS后 過膜，1200rpm離心5分鐘棄上清，所剩細胞用PBS洗滌1-2次，最后用1640 (10%FBS)調 節細胞濃度。.
[0100] 4. 5. 1細胞毒性：96孔培養板中加入90yL細胞（細胞濃度5.OX106/mL)，45yL 的藥物（對照加45yL的DMS0)，同時加入45yL含10 %FCS的RPMI-1640培養液，總體積 180yL。每實驗組設3個復孔，另設3孔加入RPMI-1640 (含10%FCS)培養液作為細胞增 殖的本底對照。細胞于含5% 0)2的37°C培養箱中培養48小時，結束培養前4-5小時每孔 加入18yLMTT(5mg/mL)。培養結束時，加入溶解液90y1，放置6-7小時左右，用酶標儀于 570nm處測0D值。用以下公式計算藥物對淋巴細胞的細胞毒性：
[0101]
[0102] 4. 5. 2細胞增殖：96孔培養板中加入100yL細胞（細胞濃度5.OX106/mL)，終濃 度為5yg/ml的ConA或者終濃度為10yg/ml的LPS，同時加入SLG-e蛋白提取物（七個 濃度yg/ml)，終體積200iil。每實驗組設3個復孔。細胞于含5% 0)2的培養箱中培養 48小時，用3H摻入法測細胞增殖。
[0103] 4. 6試驗結果：
[0104] 通過T、B淋巴細胞體外增殖實驗可以看到在低劑量時SLG-e對T、B淋巴細胞增殖 都有明顯的抑制作用，且具有明顯的量效關系。
【主權項】
1. 一種塞隆骨提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 粉碎； (2) 提取：減壓蒸餾提取塞隆骨脂溶性提取部位； (3) 萃取：將步驟（2)所得脂溶性提取部位用去離子水溶解，先用石油醚萃取，水相再 用乙酸乙酯進行萃取，濃縮至干得到乙酸乙酯部分； (4) 柱分咼： 干法拌樣：在乙酸乙酯部分中加入甲醇充分溶解，再加入硅膠進行拌樣，研碎至粉末 狀； 干法裝柱：在柱子中裝入硅膠和拌好的樣品，以乙酸乙酯：甲醇=1:1的溶劑作為洗脫 液進行洗脫，洗脫液干燥即得塞隆骨提取物。2. 根據權利要求1所述的塞隆骨提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟（2)為在 70攝氏度下用體積比為95%乙醇減壓蒸餾提取，提取液濃縮至干，得到塞隆骨脂溶性提取 部位。3. 根據權利要求1所述的塞隆骨提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟（4)中裝入 柱子的硅膠為200-300目。4. 根據權利要求1所述的塞隆骨提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟（4)中裝入 柱子的硅膠為拌后的樣品體積的40-60倍。5. 根據權利要求1所述的塞隆骨提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟（4)中洗脫 時依次以石油醚：乙酸乙酯=4:1 ;2:1和1:1進行梯度洗脫。6. 根據權利要求1所述的塞隆骨提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟（4)中通過 TLC的位置和顯色確定餾分是否一致，收集餾分一致的部分進行干燥得塞隆骨提取物。7. 權利要求1-6任一項所述的制備方法制備的塞隆骨提取物。8. 權利要求7所述的塞隆骨提取物在制備抗炎鎮痛藥物中的應用。9. 一種具有抗炎鎮痛活性的中藥制劑，其特征在于，由權利要求7所述的塞隆骨提取 物或者添加藥物學常用的輔料和藥學可接受的載體制成。10. 根據權利要求9所述的具有抗炎鎮痛活性的中藥制劑，其特征在于，所述塞隆骨提 取物的質量分數20-90%。
【專利摘要】本發明公開了一種塞隆骨提取物的制備方法，包括以下步驟：（1）粉碎；（2）提取骨脂溶性提取部位；（3）萃取：先用石油醚萃取，水相再用乙酸乙酯進行萃取，濃縮至干得到乙酸乙酯部分；（4）柱分離：在硅膠柱中以乙酸乙酯:甲醇=1:1的溶劑作為洗脫液進行洗脫，干燥即得塞隆骨提取物。本發明還公開由上述的制備方法制備的塞隆骨提取物及其在制備抗炎鎮痛藥物中的應用和具有抗炎鎮痛活性的中藥制劑。本發明所獲得的塞隆骨提取物具有抗炎鎮痛活性，可以制備抗炎鎮痛藥物，尤其是中藥制劑。該中藥制劑中的塞隆骨提取物可占制劑總質量的20-90%，其余可添加藥物學常用的輔料和藥學可接受的載體。
【IPC分類】A61P29/00, A61K35/32
【公開號】CN105055449
【申請號】CN201510445565
【發明人】趙曉輝, 岳會蘭, 陶燕鐸, 邵赟
【申請人】中國科學院西北高原生物研究所
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月27日