BSA)的PBS緩沖液中，37°C孵育2h。
[0052] (2)蛋白標準品體系的配制：取ImL2.Omg/mL蛋白標準品，PBS為稀釋液，配制成 不同濃度的蛋白標準品，如表2所示，備用，以做標準曲線。
[0053] 表2蛋白標準品的制備
[0054]
[0055]注：表中" 175 的B液"、"325 的C液"、"325 的E液"、"325 的F液"、"100的G液"， 是指向其中加入相應量的蛋白標準品B、蛋白標準品C、蛋白標準品E、蛋白標準品F或蛋白 標準品G，例如，蛋白標準品B，就是在375yL2.Omg/mL的BSA中加入125yL稀釋液配制而 成，而蛋白標準品D就是在175yL的蛋白標準品B中加入175yL稀釋液配制而成，蛋白標 準品E就是在325yL的蛋白標準品C中加入325yL稀釋液配制而成，以此類推蛋白標準 品F、G、H的制備。
[0056] (3)根據樣品數量，配制適量的BCA工作液，總的BCA工作液=(標準品+待測樣 品）X重復次數X每個樣品所需要的工作液200yL。按照體積比試劑A:試劑B= 50:1 進行配制，B往A中加，顛倒混勻。將工作液加入到96孔板中，每孔200yL。
[0057] (4)再取已經配制好的蛋白標準品加到工作液中，每孔20yL。將待檢測樣品，即 浸潤材料的BSA游離液，加到工作液中，每孔20yL。振蕩30s充分混勻，37°C孵育30min。
[0058] (5)冷卻至室溫，在酶標儀上的波長為562nm處檢測吸光度值。根據標準蛋白溶液 繪制的標準曲線，計算出檢測樣品的蛋白濃度。
[0059] (6)材料吸附的蛋白量=Img-游離液總蛋白；其中Img是總的蛋白量，游離液總 蛋白是指通過酶標儀測定的液體中的蛋白量，總的蛋白量減去液體中游離的蛋白量，即為 材料吸附的蛋白量。
[0060] 將測定的各材料吸附的蛋白量制成柱圖，如圖4所示，可見，OBC表面吸附的蛋白 質最多，OBC/SF復合膜所吸附的蛋白含量是減少的，BC/SF*和OBC/SF*吸附的蛋白質是介 于BC/SF和OBC/SF之間。BC與OBC比較，P( = 0? 009)〈0? 05,OBC與OBC/SF比較，P(= 0. 008)〈0. 05,有顯著性差異。可見，加了SF后，抗凝效果好；考慮到體內使用的情況，復合 材料制成人工血管使用時，SF與OBC必須具備良好的結合力，不然SF在人體內很快會溶于 體液，因此，OBC/SF*復合材料更加適合于人工血管制備。
[0061] 血小板粘附試驗：人血漿中血小板在材料表面的粘附情況可作為一個重要的測 試來評價材料的血液相容性。血小板的延伸與聚集是血小板激活的標志，是血栓形成的重 要機制。本例以來自健康志愿者的新鮮全血進行試驗，將采集的新鮮全血以1000 rpm離心 15min，獲得富血小板血漿（縮寫為PRP)。本例的血小板粘附試劑具體如下：
[0062] (I)PBS浸濕直徑為6mm的圓片樣品24h，將材料轉入96孔板中，加0. 2mL富血小 板血漿中，37°C恒溫60min，之后用5mL PBS漂洗，去除未粘附的血小板；
[0063] (2)將材料轉入96孔板中，用5mL PBS漂洗3次，2. 5%戊二醛固定標本過夜，PBS 沖洗3次；
[0064] (3)50%、70%、80%、90%和兩次100%酒精梯度脫水，每次15-201^11;
[0065] (4)臨界點干燥；
[0066] (5)真空噴金；
[0067] (6)掃描電鏡觀察粘附的血小板。
[0068] 電鏡掃描圖如圖5所示，其中，a為細菌纖維素膜的血小板粘附結果圖，b為羧基化 細菌纖維素膜的血小板粘附結果圖，b圖中箭頭所指部分即粘附的血小板，相似部分在d圖 中也可看見，c為細菌纖維素膜表面吸附了蠶絲蛋白后形成的復合材料的血小板粘附結果 圖，d為羧基化細菌纖維素膜表面吸附了蠶絲蛋白后形成的復合材料的血小板粘附結果圖， e為細菌纖維素膜表面交聯復合蠶絲蛋白后形成的復合材料的血小板粘附結果圖，f?為羧 基化細菌纖維素膜表面交聯復合蠶絲蛋白后形成的復合材料的血小板粘附結果圖。可見， 顯然，OBC表面的血小板數量較多，在血栓形成過程中，血小板吸附是繼蛋白吸附的下一步； 而BC/SF，BC/SF*和0BC/SF*復合膜表面幾乎沒有血小板粘附，并且血小板粘附的結果沒有 明顯差異，但是0BC/SF復合膜表面有少量血小板粘附。可見，0BC/SF*復合膜即具有良好 的生物相容性，又不會粘附血小板，比較適合用于制備人工血管。
[0069] 細胞毒性試驗：本例采用MTT法測定細胞毒性。其中，細胞培養采用DMEM/ F12 (1:1)基礎培養基，具體的，加入體積分數為10%的胎牛血清FBS，1 %的谷氨酰胺和1 % 的雙抗，混合均勻后配制成完全培養基，于37°C、5% 0)2培養箱培養人包皮成纖維細胞（縮 寫 HFF)〇
[0070] 細胞傳代：
[0071] (I)HFF細胞為貼壁細胞，先將培養瓶中的舊培養基吸除，用適量的PBS洗2遍。
[0072] (2)向瓶內加入胰酶少許，以能覆蓋瓶底為限。
[0073] (3)消化2_3min左右，顯微鏡下觀察消化程度，發現細胞慢慢變圓，細胞間隙逐漸 變大后，棄去胰酶。
[0074] (4)加入少量培養基，輕輕轉動培養瓶，把殘余消化液沖掉。
[0075] (5)加入培養基，用吸管輕輕吹打使細胞從壁上脫落，再反復吹打使其分散成單個 細胞，形成細胞懸液，轉入新的培養瓶中，加入足夠量的完全培養基，輕輕晃動混勻，37°C、 5% CO2培養箱靜置培養。
[0076] MTT細胞毒性實驗如下：
[0077] (1)將大小為IcmX Icm的各個樣品分別放入DMEM/F12-1 (1:1)培養基中孵育3 天，孵育溫度為37°C。
[0078](2)選擇對數期生長狀態良好的HFF細胞，消化后，用Sc印terTM 2. 0手持式細胞 計數器進行計數，以10000個細胞/孔，轉入96孔板中，24h后，去除細胞培養基，加入孵育 過樣品的培養基，空白對照為同體積純DMEM/F12(1:1)培養基，孵育48h。
[0079] (3)將20yL/孔5mg/mLMTT溶液加入到每個孔中并放培養箱繼續孕育4h。活細胞 線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜（Formazan) 并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。之后吸出原液，用PBS清洗1遍，吸棄孔內液后，每孔 加150yL二甲基亞砜，二甲基亞砜（DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用微量振蕩儀輕輕振蕩 IOmin使其充分溶解后。
[0080] (4)使用酶標儀，在檢測波長為570nm，參比波長為630nm條件下測定各孔吸光度 值（A)。根據公式計算細胞相對增殖率（RPR)，細胞毒性評級標準參考IS0-10993-5細胞毒 性試驗。
[0081] RPR(% ) = (At^-Ab) X 100%
[0082] 其中，At為試驗組吸光度值，A#空白對照組吸光度值，每組測三次取平均值。 將獲得的數據制成柱圖，如圖6所示，BC、OBC、BC/SF、OBC/SF、BC/SF*和0BC/SF*各材 料的相對增殖率均數分別為 83. 76±10. 68,78. 63±12. 65,82. 05±13. 32,76. 92±6. 78， 75. 21