相容性，與其它天然或人工的人工血管材料相比，血 液相容性較好；但是，在制備成人工小口徑血管時，仍然面臨堵塞率高的問題。為此，本申 請的發明人在對細菌纖維素進行長期的研究中發現，在細菌纖維素膜表面交聯復合蠶絲蛋 白，能夠很好的改善其彈性和表面性能，從而解決人工小口徑血管堵塞率高的問題；并且， 在本申請發明人之前研究的基礎上發現，羧基化細菌纖維素與蠶絲蛋白交聯復合的效果更 好。
[0034] 需要說明的是，本申請的發明人曾經對細菌纖維素進行了深入研究，并提出了對 其C6進行羧基化的方法和試劑，大大提高了細菌纖維素的加工性能，從而拓展了其應用， 詳見專利CN103157515B。本申請中涉及到的羧基化細菌纖維素，其羧基化處理方法可以參 考專利 CN103157515B。
[0035] 下面通過具體實施例對本申請作進一步詳細說明。以下實施例僅對本申請進行進 一步說明，不應理解為對本申請的限制。
[0036] 實施例
[0037] 本例的用于人工小口徑血管制備的復合材料，由C6羧基化細菌纖維素和蠶絲蛋 白組成，蠶絲蛋白和羧基化細菌纖維素通過交聯劑交聯復合形成所述復合材料。具體的，本 例采用的交聯劑為N-羥基琥珀酰亞胺和碳二亞胺。本例采用自制的C6羧基化細菌纖維素 制備復合材料，因此，本例的復合材料的制備方法包括如下步驟：
[0038] (1)細菌纖維素C6羧基化
[0039] 采用TEMPO、NaClOjP NaClO分別作為催化劑、氧化劑和助催化劑，設置不同的反 應時間、TEMPO和NaClO等級，將細菌纖維素C6位上的羥基催化氧化成為羧基，用電導率滴 定法測定羧基含量。
[0040] 具體如下：將細菌纖維素水凝膠膜從去離子水中取出，室溫條件下，用0. 25mol/L NaOH浸泡并在磁力攪拌器上攪拌48h后，取出用去離子水清洗至中性，用濾紙去除表面多 余的水分，裁剪出的膜大小為4cmX4cm，膜厚度為1mm。然后進行氧化，將裁好的膜放入盛 有IOOmL磷酸鹽緩沖液的燒杯中，磷酸緩沖液的濃度為0. 05mol/L，PH = 6. 86,然后，依次 向燒杯中加入TEMP0、NaC10jP NaCIO,并控制反應體系的溫度在60°C，邊攪拌邊進行反應， 記錄反應開始和結束的時間。其中，NaClO2的反應濃度為55mol/L，NaClO的工作液濃度為 0. lmol/L。本申請中，反應濃度是指該物質在反應液中的濃度；工作液濃度是指該物質在加 入反應液之前，其本身的濃度。
[0041] 本例為了獲得不同C6羥基氧化程度的羧基化細菌纖維素，即為了得到不同羧基 含量的羧基化細菌纖維素，分別設置了 TEMPO終濃度為0? 05mol/L，0. 10mol/L，0. 15mol/ L，0.20mol/L，0.25mol/L 和 0.30mol/L 六個等級，NaClO 終濃度為 0mol/L，0. 10mol/L， 0? 20mol/L，0? 30mol/L，0? 40mol/和0? 50mol/L六個等級，共計36組反應液進行試驗，并且， 每組反應液設置9個重復，9個重復分別的反應時間為5h、10h、15h、20h、25h、30h、35h、40h 和 60h〇
[0042] 反應結束后，用電導率滴定法測定羧基含量。具體的，反應結束后，將羧基化細 菌纖維素膜凍干，然后放入含有80mL去離子水的滴定瓶中，滴加5mL0.0 lmol/L NaCl，用 0. lmol/L HCl調節pH值在2. 5~3. 0之間，最后用0. 04mol/L NaOH在自定滴定儀上進行 電導率滴定。根據計算機記錄的電導滴定曲線軟件導出數值，通過Origin 8.0處理計算可 得到細菌纖維素氧化的羧基含量。測試結果，如圖1-3所示，圖1為反應時間對羧基含量的 影響，圖2為TEMPO用量對羧基含量的影響，圖3為NaClO用量對羧基含量的影響；由圖1 可見，在反應40h內隨著反應時間的推移，羧基含量逐步增加，而反應40h到60h之間羧基 含量增加較少，達到平穩；由圖2和圖3可見，TEMPO和NaClO的用量達到一定程度后，羧基 含量也不在增加。本例根據對反應時間、TEMPO和NaClO用量進行調節可以制備出羧基含 量0% -60%的羧基化細菌纖維素。
[0043] (2)復合材料的制備
[0044] 本例采用前面記載的沒有經過羧基化處理的細菌纖維素膜（縮寫為BC膜），以及 經過前述氧化處理的羧基化細菌纖維素膜（縮寫為OBC膜），分別與蠶絲蛋白復合，并且，在 復合的過程中，設置加交聯劑和不加交聯劑的對照組。本例采用的交聯劑為N-羥基琥珀酰 亞胺和碳二亞胺，羧基化細菌纖維素膜為經前述氧化處理的羧基含量60%的羧基化細菌纖 維素膜。具體如下：
[0045] 將裁定的大小為4cmX 4cm的BC膜和OBC膜分別放入25mL的濃度為IOwt%的蠶絲 蛋白溶液中，具體的，BC膜設置兩個重復，分別放入兩個蠶絲蛋白溶液，其中一個作為試驗 組，一個作為對照組，OBC膜設置兩個重復，分別放入兩個蠶絲蛋白溶液，同樣的，其中一個 作為試驗組，一個作為對照組。試驗組中，分別向放置BC膜的蠶絲蛋白溶液，和放置OBC膜 的蠶絲蛋白溶液中加入0.07gHOSU和0.Ilg1-(3-二甲基丙基）-3-乙基碳二亞胺/EDC， 攪拌反應48h。然后，取出膜用蒸餾水沖洗3遍，在真空干燥箱烘干。對照組，同樣進行攪拌 反應48h，只是不添加交聯劑，反應結束后，同樣取出膜用蒸餾水沖洗3遍，在真空干燥箱烘 干。獲得四個樣品，分別為細菌纖維素與蠶絲蛋白的混合材料，縮寫為BC/SF ;羧基化細菌 纖維素與蠶絲蛋白的混合材料，縮寫為OBC/SF;細菌纖維素與蠶絲蛋白交聯復合后的復合 材料，縮寫為BC/SF*;羧基化細菌纖維素與蠶絲蛋白交聯復合后的復合材料，縮寫為OBC/ SF*。需要說明的是，根據研究顯示，沒有羧基化的細菌纖維素也可以由氫鍵，通過靜電吸附 將蠶絲蛋白復合在其表面，但是，這種靜電吸附不牢固，作為人工血管使用時，蠶絲蛋白很 容易脫落，溶解到體液中，無法達到復合材料的效果；同樣的，在沒有添加交聯劑的情況下， 蠶絲蛋白也是通過靜電吸附復合在BC膜或OBC膜表面的，結合牢固程度遠不及羧基與蠶絲 蛋白的氨基直接的交聯復合。
[0046] 分別對制備的四個樣品，以及沒有混合或交聯蠶絲蛋白的BC膜和OBC膜進行測 試，測定各樣品的血液相容性、蛋白吸附性能、血小板粘附性能、細胞毒性，以及力學性能。
[0047] 血液相容性測試：溶血與植入材料血液相容性有直接關系，其指的是紅細胞膜破 裂將血紅蛋白釋放到血漿中，可用于評價材料的血液相容性。本例根據ISO 10993的規定 測定各材料的血液相容性，詳細測試方法參考ISO 10993,在此不累述。測試結果如表1所 示，可見，無論是BC、0BC，還是BC/SF、OBC/SF、BC/SF*、0BC/SF*，這些材料的血液相容性都 很好，都小于5%。試驗人員認為，這是因為細菌纖維素本身具備良好的生物相容性，這也是 為什么選擇細菌纖維素進行人工血管研究的原因。
[0048] 表1各樣品的溶血率和標準差
[0049]
[0050] 蛋白吸附測試：移植材料表面吸附蛋白的量可作為評價生物材料血液相容性的重 要指標之一。當材料接觸血液時，蛋白吸附是兩者相互作用的第一步。本例的蛋白吸附測 試具體如下：
[0051] (1)樣品材料裁成直徑為6mm的圓片后，將其浸潤在ImL含有lmg/mL牛血清白蛋 白（縮寫為