%。
[0036] 2. 4評價D0X@MA-DEX(5K)-ALN膠束的體內抗腫瘤活性
[0037] 2. 4. 1試驗分組
[0038] 雄性裸鼠隨機分為3組：荷瘤模型組、DOX組（5mg/kg)、DOX@MA-DEXw-ALN膠束 組（5mg/kg)。
[0039] 2. 4. 2荷瘤動物模型的建立
[0040] 取對數生長期的A549細胞，經洗滌、消化、離心后得到濃縮細胞，然后加入無血清 RPMI 1640培養液稀釋細胞使其濃度達到I X 107/mL，待用。將裸鼠膝關節彎曲60 °，然后 用ImL的注射器吸取IOOyL的上述細胞懸液，針頭傾斜插入裸鼠脛骨骨髓腔內，將細胞注 入，建立荷瘤動物模型。待腫瘤可觸及時，按照分組，分別靜脈注射藥物，七天后再次給予相 同劑量藥物。
[0041] 2. 4. 3觀察指標
[0042] ①觀察腫瘤的體積變化：每天觀察腫瘤生長情況，根據公式計算腫瘤體積。
[0043] Tumor Volume = LXW2XO. 5 (L，W分別代表腫瘤最長直徑和最短直徑）
[0044] ②觀察裸鼠的體重變化。記錄動物體重變化，繪制體重變化曲線，觀察藥物對動物 體重的影響。
[0045] ③Micro-CT觀察骨轉移瘤處骨質的變化。
[0046] 3實驗結果：
[0047] 3. 1包封率及載藥量
[0048] 表1 Doxoma-DExw-ALN膠束的載藥量及包封率
[0049]
[0050] 結果顯示本專利設計的膠束具有高載藥量和高包封率特性。
[0051] 3. 2體外抗腫瘤活性
[0052] Doxoma-DEXw-ALN膠束對 A549 細胞、PC-3 細胞、MDA-MB-231 細胞和 MDA-MB-231/ ADR細胞的毒性具有明顯的濃度依賴性，隨著DOX濃度的增大細胞存活率逐漸降低。相比于 DOX，DOXOMA-DEXei0-ALN 膠束對 A549 細胞、PC-3 細胞、MDA-MB-231 細胞和 MDA-MB-231/ADR 細胞的毒性更強。DOX對MDA-MB-231/ADR細胞幾乎無毒性，而D0X@MA-DEXeK)-ALN膠束顯 示出較強的細胞毒性。
[0053] 細胞毒性研究為評價藥物體外抗腫瘤活性的重要指標，上述結果顯示，DOXO MA_DEX (5K) - ALN膠束對腫瘤細胞具有突出的細胞毒性，同時對于耐藥腫瘤細胞也具有良好 的體外抗腫瘤效果。
[0054] 3. 3體內抗腫瘤活性
[0055] 圖IA是利用普通相機記錄的各組荷瘤裸鼠的生長情況，圖IB所示為荷瘤裸鼠 腫瘤體積的變化。從圖中可以看出，空白對照組的裸鼠腫瘤體積增長迅速。在第30天的 時候，空白對照組的平均腫瘤體積已經增加到4168±204mm 3。DOX組的治療能一定程度抑 制腫瘤的快速增長，在第30天腫瘤體積到達了 2711±372mm3。而相同劑量條件下，DOXO MA-DEX(5K)-ALN表現出比DOX更好的抗腫瘤效果。在給藥第30后D0X@MA-DEX (5K)-ALN給藥 組裸鼠腫瘤體積為789±118mm3。圖IC為不同給藥組對荷瘤裸鼠的腫瘤抑制率。從圖中可 以看出D0X@MA-DEX(5K)-ALN相比于DOX具有更好的腫瘤抑制能力。實驗結束后，D0X、D0X@ MA-DEXw-ALN的腫瘤抑制率分別是38. 4%，67. 9%。
[0056] 圖2所示為裸鼠的體重變化。從圖中可以看出所有裸鼠在最初的兩周內體重都有 緩慢上升，但是隨著治療時間的延長，空白對照組和DOX給藥組裸鼠的體重出現迅速下降 趨勢。D0X0MA-DEX (5K) -ALN給藥組的裸鼠體重略有下降。體重變化是衡量DOX對機體毒副 作用的一個重要指標，DOX裝載于MA-DEX(5K)-ALN膠束后，體重變化較游離DOX顯著降低，毒 副作用明顯下降。
[0057] 利用Micro-CT對骨轉移瘤處的骨組織進行掃描。從圖3A、圖3B中可以看出陽性 對照組的小鼠脛骨及腓骨處被嚴重破壞，呈現出明顯的溶骨性病變，皮質破壞，大多數骨小 梁消失。而DOX組的裸鼠脛骨及腓骨處呈現出中度破壞，部分皮質尚完整存在，骨小梁也 相對較多。D0X@MA-DEX (5K)-ALN給藥組對骨質的破壞較小，與陰性對照組相比，骨質基本保 持完整形態。圖3C、圖3D結果是利用Micro-CT分析軟件對脛骨骨小梁的體積以及數量做 了進一步的分析。結果顯示D0X@MA-DEX(5K)-ALN給藥組可以明顯改善腫瘤細胞對骨小梁的 破壞作用。同時利用Micro-CT對脛骨近端的骨密度值進行了檢測，從結果可以看出DOXO MA-DEX w-ALN給藥組骨密度值均大于DOX組，且具有顯著性差異；D0X_V-DEXeK)-ALN與正 常對照組相比，沒有顯著性差異。結果說明D0X@MA-DEX (5K)-ALN通過積極地抗腫瘤作用能夠 減弱腫瘤對骨質的侵襲，減輕對骨密度的降低作用。
[0058] 4 結論：
[0059] 體內外的抗腫瘤實驗結果表明，與游離DOX相比，D0X@MA-DEX(5K)-ALN膠束可有效 提高DOX在腫瘤組織的富集，同時顯著減少DOX在正常組織的分布，減輕毒副作用，呈現出 顯著增強的抗腫瘤活性，具有良好的開發前景。
【主權項】
1. 一種可用于治療骨轉移癌的氧化還原敏感骨靶向膠束，其特征是以阿侖膦酸鈉 (ALN)為骨靶向配基，以分子量5000的葡聚糖（DEX (5K))為親水材料，以十四胺（M)為 疏水材料，以3,3二硫二丙酸（0?〇為交聯劑合成獻-0￡乂(51()41^，以阿霉素（0(?)為 模型藥物，制備出兼有主動骨靶向及對腫瘤細胞微環境有特異性響應的納米膠束DOXO MA-DEX (5K)-ALN ； 具體制備方法如下： (1) 二硫二丙酸-阿侖膦酸鈉（DPC-ALN)的合成方法 @在2011^的1，4二氧六環中加入2.4臟〇1的0?〇501.111^，4.8臟〇1的￡0(：1916.811^，攪拌30min，然后加入5. Ommol的NHS 575. 2mg以及150 y L的TEA，繼續攪拌活化3h ;②在 20mL的蒸餾水中加入I. 2mmol的ALN 325. 6mg，充分溶解后，分三批次緩慢滴加入上述反應 液，在反應過程中，緩慢滴加0. 2M NaOH使反應液的pH值穩定維持在7. 0左右，2小時后繼 續滴加0. 2M NaOH使pH調成9. 0,繼續反應過夜，反應結束后旋干溶劑，固體用大量二氯甲 烷反復潤洗三次，甲醇潤洗三次，得產物； (2) 二硫二丙酸-十四胺（DPC-M)的合成方法 在 20mL 的 1,4 二氧六環中加入 2.4mmol 的 DPC 500mg，4.8mmol 的 EDCI 916.8mg，攬摔 30min，然后加入5. Ommol的NHS 575. 2mg以及150 y L的TEA，繼續攪拌活化3h，隨后在反 應液中加入I. 3mmol的MA 217. 6mg，室溫反應12h，TLC監測反應，結束反應后，過柱分離， 其中展開劑以體積比計為：二氯甲烷：甲醇=10:1 ; (3) 葡聚糖w_3, 3二硫二丙酸-十四胺（DEXw-DPC-M)的合成方法 稱取一定量的DPC-MA、EDCI、NHS和TEA依次溶于30mL的DMSO中，充分溶解后加入一 定量的DEXtel0，室溫反應12h，結束反應后，過濾反應液，得淡黃色澄清液體，濾液用大量二 氯甲烷沉淀，并反復用二氯甲烷清洗沉淀，甲醇潤洗沉淀三次，最后將沉淀溶于少量蒸餾水 中透析凍干，即得DEX (5K)-DPC-OA ; (4) 十四胺-3, 3二硫二丙酸-葡聚糖w-3, 3二硫二丙酸-阿侖膦酸鈉 (ma-dpc-dex(5K)-dpc-aln)的合成方法 稱取一定量的DPC-ALN、EDCI、NHS和TEA依次溶于40mL的DMSO中，充分溶 解后加入一定量的DEX(5K)-DPC-MA，油浴60 °C反應48h，反應結束后透析凍干即得 MA-DPC-DEX(5K)-DPC-ALN，縮寫為 MA-DEX(5K)-ALN ; (5) MA-DEX(5K)-ALN載阿霉素（DOX)膠束的制備 稱取3mg DOX ? HCl于4mL DMSO中，再加入3 y L的TEA，在60°C油浴中避光磁力攪拌 Ih使其充分溶解，加IOmg的MA-DEX(5K)-ALN于制備液中，持續攪拌2h后緩慢滴加蒸餾水 32mL，繼續攪拌12h ;將上述混合液裝入分子截留量為2000的透析袋中，透析48h，每6h換 一次水，透析后冷凍干燥得聚合物載藥膠束。
【專利摘要】本發明公開了一種可用于治療骨轉移癌的氧化還原敏感骨靶向膠束，該膠束以阿侖膦酸鈉(ALN)為骨靶向配基，以分子量5000的葡聚糖(DEX(5K))為親水材料，以十四胺(MA)為疏水材料，以3,3二硫二丙酸(DPC)為交聯劑，以阿霉素(DOX)為模型藥物，制備出兼有主動骨靶向及對腫瘤細胞微環境有特異性響應的膠束DOXMA-DEX(5K)-ALN。該骨靶向膠束DOXMA-DEX(5K)-ALN對DOX具有較高的載藥量與包封率，可明顯增加DOX對羥基磷灰石(HA)的吸附量，將更多的DOX遞送至骨轉移瘤處，從而使DOX在腫瘤組織富集，增加DOX對骨轉移癌的治療作用，減輕腫瘤對骨的破壞作用；同時降低DOX在正常組織的分布，提高DOX的療效，降低毒副作用，為治療骨轉移癌遞藥系統的開發提供新思路。
【IPC分類】A61K9/51, A61K31/704, A61P35/04, A61K47/36
【公開號】CN105012272
【申請號】CN201510390107
【發明人】周四元, 葉威良, 成穎, 劉苗, 崔晗, 劉道洲, 宦夢蕾, 趙一浦, 李懷秋
【申請人】中國人民解放軍第四軍醫大學
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月6日