一種可用于治療骨轉移癌的氧化還原敏感骨靶向膠束的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種新型葡聚糖（DEX)氧化還原敏感骨靶向膠束的設計制備及應用 方案。
【背景技術】
[0002] 研究發現至少50%的癌癥晚期患者會出現骨轉移的現象。腫瘤骨轉移的發生影響 了藥物對腫瘤的治療，增加了患者的疼痛，降低了患者的存活率。由于骨質硬度大、血管分 布少、藥物滲透性低等特點，傳統給藥方式很難將藥物有效遞送至骨轉移瘤處。如何有效遞 送藥物，是解決骨轉移瘤治療難題的關鍵。骨靶向遞藥系統的提出，為骨轉移瘤的治療帶來 了曙光。
[0003] 雙膦酸鹽類（BPs)對骨的HA具有很高的親和力。一旦BPs進入體內后，BPs就會 被快速從血液循環中清除而吸附到暴露的骨礦物質區域。阿侖膦酸鈉（ALN)屬于第三代 BPs類藥物，具有很強的親骨性，其結構簡單，可化學修飾，被廣泛用作遞藥系統中的骨靶向 配體。研究表明，對環境響應的遞藥系統對藥物的可控釋放起到關鍵作用。二硫鍵是一種 對谷胱甘肽（GSH)敏感的化學鍵，在腫瘤細胞內外GSH的含量差別巨大。其中腫瘤細胞內 GSH的濃度可達到2-10mM，而腫瘤細胞外GSH的濃度約為2-20 μ M，濃度幾乎相差1000倍。 利用二硫鍵連接的遞藥系統可以選擇性的將藥物釋放在GSH含量高的腫瘤細胞內，而在血 液中可以穩定存在。
[0004] 葡聚糖（DEX)具有良好的生物相容性和水溶性，已被廣泛應用于生物醫藥領域。 基于DEX制備的膠束遞藥系統，因其具有粒徑小、載藥力強等特征已被廣泛研究。最近的研 究還表明基于DEX的膠束在體內循環也具有類似PEG "隱形"的功能。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種可用于治療骨轉移癌的氧化還原敏感骨靶向膠束，可以 將更多DOX遞送到骨轉移瘤處，同時顯著降低DOX在正常組織的分布，從而有效提高DOX的 抗腫瘤活性，降低其毒副作用，為治療骨轉移癌遞藥系統的開發提供新思路。
[0006] -種可用于治療骨轉移癌的氧化還原敏感骨靶向膠束，其特征是以阿侖膦酸 鈉（ALN)為骨靶向配基，以分子量5000的葡聚糖（DEX (5K))為親水材料，以十四胺（M) 為疏水材料，以3, 3二硫二丙酸（DPC)為交聯劑合成MA-DEX(5K)-ALN，以阿霉素（DOX)為 模型藥物，制備出兼有主動骨靶向及對腫瘤細胞微環境有特異性響應的納米膠束DOXO MA-DEX w-ALN。
[0007] 具體制備方法如下：
[0008] (1)二硫二丙酸-阿侖膦酸鈉（DPC-ALN)的合成方法
[0009] ①在 20mL 的 1，4 二氧六環中加入 2. 4mmol 的 DPC 501. lmg，4. 8mmol 的 EDCI 916. 8mg，攪拌30min，然后加入5. Ommol的NHS 575. 2mg以及150 μ L的TEA，繼續攪拌活化 3h ;②在20mL的蒸餾水中加入I. 2mmol的ALN 325. 6mg，充分溶解后，分三批次緩慢滴加入 上述反應液，在反應過程中，緩慢滴加0. 2M NaOH使反應液的pH值穩定維持在7. O左右，2 小時后繼續滴加0. 2M NaOH使pH調成9. 0,繼續反應過夜，反應結束后旋干溶劑，固體用大 量二氯甲烷反復潤洗三次，甲醇潤洗三次，得產物；
[0010] (2)二硫二丙酸-十四胺（DPC-M)的合成方法
[0011]在 20mL 的 1，4 二氧六環中加入 2. 4mmol 的 DPC 500mg，4. 8mmol 的 EDCI 916. 8mg， 攪拌30min，然后加入5. Ommol的NHS 575. 2mg以及150 μ L的TEA，繼續攪拌活化3h，隨后 在反應液中加入I. 3_〇1的M 217. 6mg，室溫反應12h，TLC監測反應，結束反應后，過柱分 離，其中展開劑以體積比計為：二氯甲烷：甲醇=10:1 ;
[0012] (3)葡聚糖(5K)-3, 3二硫二丙酸-十四胺（DEXw-DPC-MA)的合成方法
[0013] 稱取一定量的DPC-MA、EDCI、NHS和TEA依次溶于30mL的DMSO中，充分溶解后加 入一定量的DEX w，室溫反應12h，結束反應后，過濾反應液，得淡黃色澄清液體，濾液用大 量二氯甲烷沉淀，并反復用二氯甲烷清洗沉淀，甲醇潤洗沉淀三次，最后將沉淀溶于少量蒸 餾水中透析凍干，即得DEX (5K)-DPC-OA ;
[0014] (4)十四胺-3, 3二硫二丙酸-葡聚糖teK)-3, 3二硫二丙酸-阿侖膦酸鈉 (ma-dpc-dex(5K)-dpc-aln)的合成方法
[0015] 稱取一定量的DPC-ALN、EDCI、NHS和TEA依次溶于40mL的DMSO中，充分 溶解后加入一定量的DEX eK) -DPC-M，油浴60 °C反應48h，反應結束后透析凍干即得 MA-DPC-DEX(5K)-DPC-ALN，縮寫為 MA-DEX(5K)-ALN ;
[0016] (5)MA-DEXw-ALN載阿霉素（DOX)膠束的制備
[0017] 稱取3mg DOX · HCl于4mL DMSO中，再加入3 μ L的TEA，在60°C油浴中避光磁力 攪拌Ih使其充分溶解，加 IOmg的MA-DEX(5K)-ALN于制備液中，持續攪拌2h后緩慢滴加蒸餾 水32mL，繼續攪拌12h ;將上述混合液裝入分子截留量為2000的透析袋中，透析48h，每6h 換一次水，透析后冷凍干燥得聚合物載藥膠束。
[0018] 本發明骨靶向膠束D0X_V-DEX(5K) -ALN對DOX具有較高的載藥量與包封率，可明顯 增加 DOX對羥基磷灰石（HA)的吸附量，將更多的DOX遞送至骨轉移瘤處，從而使DOX在腫 瘤組織富集，增加 DOX對骨轉移癌的治療作用，減輕腫瘤對骨的破壞作用；同時降低DOX在 正常組織的分布，提高DOX的療效，降低毒副作用。
【附圖說明】
[0019] 圖1是DOX及D0X@MA-DEX(5K)-ALN膠束治療荷瘤裸鼠后腫瘤體積的變化圖。裸鼠 脛骨骨髓腔注射A549細胞造模，尾靜脈給藥。A :普通相機觀察荷瘤裸鼠腫瘤體積；B :測 量荷瘤裸鼠腫瘤體積變化；C :各給藥組腫瘤體積抑制率。η = 3, ?土S，*P〈0. 05, VS DOX ; #P〈0. 05,VS Control。
[0020] 圖2是DOX及D0X@MA-DEX(5K)-ALN膠束治療荷瘤裸鼠后裸鼠體重的變化曲線圖。 裸鼠脛骨骨髓腔注射A549細胞造模，尾靜脈給藥。η = 3,〒:tS, *P〈0. 05, VS D0X。
[0021 ] 圖3是DOX及D0X0MA-DEX (5K) -ALN膠束治療荷瘤裸鼠后荷瘤裸鼠右后肢 Micro-CT重建（A)及矢狀位圖像（B);荷瘤裸鼠右后肢Micro-CT數據分析（C和D)。BV/ TV 為骨體積 / 組織體積。η = 3, J士S，*Ρ〈0· 05, VS D0X。
[0022] 具體實施方法
[0023] D0X@MA-DEX(5K)-ALN膠束的體內外抗腫瘤活性研究
[0024] 1目的：通過體內外實驗，評價D0X_V-DEX(5K)-ALN膠束的抗腫瘤活性。
[0025] 2研究方法：
[0026] 2. 1包封率及載藥量測定
[0027] 應用熒光分光光度法測定DOX濃度，激發波長為470nm，發射波長為597nm，用DMSO 作為溶媒配制100 μ g/mL DOX標準儲備液，然后分別稀釋為0. 1、1.0、2.0、5.0、10. 0、15. 0、 25. 0 μ g/mL，熒光分光光度計測定熒光強度，以熒光強度對濃度進行線性擬合，得到檢測 DOX 標準曲線的回歸方程為 y = 20. 118x-15. 352, R2= 0. 9976。其中 DOX 在 0. 1-25 μ g/mL 范圍內，熒光光度值與濃度具有良好的線性關系。
[0028] 稱取Img的載藥膠束D0X_V-DEXeK)-ALN溶解于3mLDMS0中，測定DOX熒光強度， 每個樣品測定三次。載藥量以及包封率由以下公式計算：
[0029] 載藥量=(膠束中藥物量/膠束的量）X 100%
[0030] 包封率=(膠束中包封的藥物量/制備膠束投入的藥物總量）X 100%
[0031] 2. 2評價D0X_V-DEX(5K)-ALN膠束與HA的吸附動力學
[0032] 精密稱取Img的DOX和D0X_V-DEX(5K)-ALN膠束溶解于IOmL的PBS中，測定溶液 的吸光度值，記錄數據。然后分別加入IOOmg的HA攪拌，在5、15、30和60min時，樣品于 5000rmp離心10min，吸取上清液分別測定吸光度值。
[0033] 吸附率=[(測前-測后）/測前]X100%
[0034] 2. 3評價DOX@MA-DEXw-ALN膠束的體外細胞毒性
[0035] 利用MTT法測定DOX以及DOX_V-DEXw-ALN膠束對A549細胞、PC-3細胞、 MDA-MB-231細胞及MDA-MB-231/ADR細胞的毒性作用。取對數生長期的腫瘤細胞，用0. 25% 的胰蛋白酶消化，接種于96孔板（細胞濃度IXioVmL,接種體積200 yL)。置于孵箱 (37°C )中培養24h，棄去培養液。分別將DOX和D0X@MA-DEX(5K)-ALN膠束溶于無血清的培 養液中，以不加藥物為陰性對照組。膠束折合DOX的濃度分別為0. 08、0. 8、8. O和40.0 μ g/ mL，每孔加入200 μ L藥物溶液，孵育24h。每孔加入20 μ L MTT溶液，繼續培養4h后棄去培 養液，每孔加入200 μ L的DMSO。將培養板置于搖床振搖lOmin，酶標儀490nm處測定吸光 度值。細胞生存率％ =(給藥后的吸光度值/陰性對照的吸光度值）X 100