氨 基酸的α -甲基-谷氨酸。另外，CA表示4-咪唑并乙酰基，DA表示脫氨基-組氨酰基，并 且（d) S表示d-絲氨酸。
[0219] 實施例2-2 :測量胄泌酸調節素類似物的體外活件
[0220] 為測量上述實施例2-1制備的肽的效果，利用實施例1-1和1-2制備的轉化體測 量細胞中的肽的體外活性。
[0221] 各轉化體被轉化以在CHO(中國倉鼠卵巢）中表達人GLP-I受體和胰高血糖素受 體基因中的每一個，并且適于測量GLP-I和胰高血糖素的活性。因此，利用各轉化體測量各 胃泌酸調節素類似物的活性。
[0222] 具體地，將各轉化體繼代培養一周兩次或三次，并且將細胞以IX IO5個細胞/孔 的密度分配到96孔板的各孔中并培養24小時。
[0223] 將培養的細胞用KRB緩沖劑洗滌，懸浮于40ml的ImM含IBMX的KRB緩沖劑，然后 使其在室溫下留置5分鐘。將各胃泌酸調節素 （SEQ ID NO :1)和胃泌酸調節素類似物（SEQ ID NO :2-6、8、10-13、17、18、23-25、27、28 和 32-34)從 1000 nM 至 0· 02nM 以五倍系列稀釋， 并將40 ml各稀釋液加入細胞，然后在37°C的CO2培育箱中培育1小時。然后，加入20ml細 胞溶解緩沖劑以溶解細胞，并利用cAMP分析試劑盒（Molecular Device，USA)測量各細胞 溶解產物的cAMP濃度。根據測量結果，計算EC5tl值，并相互比較（表2)。
[0224] 表 2
[0225] 胃泌酸調節素類似物之間GLP-I受體和胰高血糖素受體的體外活性的比較
[0226]
[0227] 在上表2中可見，胃泌酸調節素類似物，與SEQ ID NO :1的胃泌酸調節素相比，顯 示良好的體外GLP-I和胰高血糖素受體活性。
[0228] 已知胃泌酸調節素具有通過激活GLP-I受體和胰高血糖素受體治療肥胖、高脂 血、脂肪肝病或動脈硬化的效果。根據本發明的胃泌酸調節素類似物與天然胃泌酸調節素 相比具有體外激活GLP-I受體和胰高血糖素受體的高性能，表明這些胃泌酸調節素類似物 與天然胃泌酸調節素相比高度有效治療糖尿病、糖胖病或糖尿病并發癥。
[0229] 實施例3 :制各包括胄泌酸調節素類似物（SEQ ID NO :23)和免痔球蛋白Fc綴合 物（免痔球蛋白Fc綴合塑胄泌酸調節素類似物23)
[0230] 為在胃泌酸調節素類似物（SEQ ID NO :23)的氨基酸序列第24位的半胱氨酸殘 基處PEG化MAL-10K-ALD PEG(N0F.，日本），使胃泌酸調節素類似物（SEQ ID N0:23)和 MAL-10K-ALD PEG在3 mg/m￡的蛋白質濃度下在室溫下以1 :3的摩爾比彼此反應3小時。反 應在包含IM胍的50mM Tris緩沖劑（pH 8.0)中進行。反應完成后，將反應溶液在下列條 件下施加于SOURCE S，從而純化在半胱氨酸處單PEG化的胃泌酸調節素類似物：柱：SOURCE 3，流速：2.0陽(/丨11丨11，梯度40->100%501^118仏：201111檸檬酸鈉&!13.0)+45%乙醇，8 : A+1M KC1)〇
[0231] 然后，使純化的單PEG化的胃泌酸調節素類似物（SEQ ID NO :23)和免疫球蛋白Fc 在20 mg/ml的蛋白質濃度下在4°C下以1 :5的摩爾比彼此反應16小時。反應在包含20mM SCB作為還原劑的IOOmM磷酸鉀緩沖劑（pH 6.0)中進行。反應完成后，將反應溶液施加 于5(^^^純化柱（柱5(^1^^150，流速：2.0時加丨11，梯度40->4%11^11，8->20%801^11 B (A :20mM Tris-HCl，pH 7. 5, B :A+1M NaCl))和 Source ISO 柱（柱：SOURCE IS0,流速： 2.0 mf/min,梯度：B 0->100% IOOmin A，（A :20mM Tris-HCl，pH 7· 5，B :A+1. IM AS))，從而 純化包括胃泌酸調節素類似物（SEQ ID NO :23)和免疫球蛋白Fe的綴合物。
[0232] 實施例4 :制各包括胄泌酸調節素類似物（SEQ ID NO :25)和免痔球蛋白Fe的綴 合物（免痔球蛋白Fe綴合塑胄泌酸調節素類似物25)
[0233] 為在胃泌酸調節素類似物（SEQ ID NO :25)的氨基酸序列第30位的半胱氨酸殘 基處PEG化MAL-10K-ALD PEG，使胃泌酸調節素類似物（SEQ ID N0:25)和MAL-10K-ALD PEG在3 mg/rM的蛋白質濃度下在室溫下以1:3的摩爾比彼此反應3小時。反應在包含 IM胍的50mM Tris緩沖劑（pH 8.0)中進行。反應完成后，將反應溶液在下列條件下施加 于SOURCE S，從而純化在半胱氨酸處單PEG化的胃泌酸調節素類似物：柱：SOURCE S，流 速：2.0^^7丨1如，梯度40->100%5011^118仏：201111檸檬酸鈉&!13.0)+45%乙醇，8 4+1]\1 KC1) 〇
[0234] 然后，使純化的單PEG化的胃泌酸調節素類似物（SEQ ID NO :25)和免疫球蛋白Fe 在20 mg/m』的蛋白質濃度下在4°C下以1 :5的摩爾比彼此反應16小時。反應在包含20mM SCB作為還原劑的IOOmM磷酸鉀緩沖劑（pH 6.0)中進行。反應完成后，將反應溶液施加 于 SOURCE 15Q柱（柱：SOURCE 15Q，流速：2.〇mi7min,梯度：Α0-Μ% Imin B->20% 80min B (A :20mM Tris-HCl (pH 7· 5)，B :A+1M NaCl))和 Source ISO 柱（柱：SOURCE ISO,流速： 2.0 m￡/min,流速：B 0->100% IOOmin A(A :20mM Tris-HCl(pH 7. 5)，B :A+1. IM AS))，從而 純化包括胃泌酸調節素類似物（SEQ ID NO :25)和免疫球蛋白Fe的綴合物。
[0235] 實施例5 :制各包括胄泌酸調節素類似物（SEQ ID NO :27)和免痔球蛋白Fe的綴 合物（免痔球蛋白Fe綴合塑胄泌酸調節素類似物27)
[0236] 為在胃泌酸調節素類似物（SEQ ID NO :27)的氨基酸序列第30位的在半胱氨酸 殘基處PEG化MAL-10K-ALD PEG，使胃泌酸調節素類似物（SEQ ID N0:27)和MAL-10K-ALD PEG在3 mg/m￡的蛋白質濃度下在室溫下以1 :3的摩爾比彼此反應3小時。反應在包含IM 胍的50mM Tris緩沖劑（pH 8.0)中進行。反應完成后，將反應溶液在下列條件下施加于 SOURCE S，從而獲得在半胱氨酸處單PEG化的胃泌酸調節素類似物：柱：SOURCE S，流速： 2.0〖<%1丨11,梯度40->100%5011^118仏：201111檸檬酸鈉（?!13.0)+45%乙醇，8 4+1]\11((：1)。
[0237] 然后，使純化的單PEG化的胃泌酸調節素類似物（SEQ ID NO :27)和免疫球蛋白Fc 在20 mg/ml的蛋白質濃度下在4°C下以1 :5的摩爾比彼此反應16小時。反應在包含20mM SCB作為還原劑的IOOmM磷酸鉀緩沖劑（pH 6.0)中進行。反應完成后，將反應溶液施加 于 SOURCE 15Q柱（柱：SOURCE 15Q，流速：2.〇m々mm，梯度：AO-Μ% Imin B->20%80min B (A :20mM Tris-HCl (pH 7. 5)，B :A+1M NaCl))和 Source ISO 柱（柱：SOURCE ISO,流速： 2.0 mMniii,梯度：B 0->100% IOOmin A(A :20mM Tris-HCl(pH 7. 5)，B :A+1. IM AS))，從而 純化包括胃泌酸調節素類似物（SEQ ID NO :27)和免疫球蛋白Fe的綴合物。
[0238] 實施例6 :長效胄泌酸調節素類似物對高脂肪飲畬誘導塑肥胖（HF DI0)小鼠的體 重和血糖水平下降的效果
[0239] 實施例6-1 :實駘方法
[0240] 6 周齡小鼠（C57BL/6，120-130g)購自 OrientBIO (韓國）。購買的 C57BL/6 小鼠是 廣泛用于肥胖和糖尿病研宄的動物，因為其肥胖可相對容易通過高脂肪飲食誘導。HF DIO 小鼠是頻繁用于糖尿病研宄的嚙齒類，并且由于在無遺傳操縱的情況下將高脂肪飲食移植 到器官中而天然地顯示類似于人的肥胖和糖尿病狀況，這與患有通過瘦蛋白受體的突變誘 導的糖尿病的db/db小鼠不同。因此，在本發明中，利用這些動物檢驗本發明的組合物對糖 胖病中的體重和血糖水平下降的效果。
[0241] 使動物獲得通過UV照射滅菌的高脂肪飲食（60% Kcal來自脂肪飲食，D12492 ; Research Diets Inc.)。而且，利用水瓶使動物獲得過濾后的和UV滅菌的自來水。將動物 在12-hr光照/12-hr黑暗循環（光照：am 6至pm 6)下圈養在滿足GLP標準的養殖室中， 并且全部實驗程序按照動物實驗標準指導進行。藥物給予在26周肥胖誘導后開始，并且將 動物分成五組（η = 6)，如下表3所示。
[0242]表 3 [0243]
[0244] 具體地，將第1組（HF DIO誘導組，對照組）用高脂肪飼料飼養，并皮下給予5ml/ kg (注射體積）Dulbecco磷酸緩沖鹽水（DPBS，Sigma) -周一次或多次。關于血糖耐受性測 試，將第1組在測試前24小時皮下給予Dulbecco磷酸緩沖鹽水（DPBS，Sigma)，并禁食16 小時。從尾部采集血液，以測量禁食葡萄糖水平，并且測量腹內給予lg/kg葡萄糖后15min、 30min、60min、90min 和 120min 的血糖水平。
[0245] 將第2組（HF DIO誘導且lOOnmol/kg VICTOZA1?給藥組）用高脂肪飲食飼養以 誘導肥胖和高血糖，然后一日一次皮下給予5ml/kg (注射體積）市售VICTOZA? (GSK)。關 于血糖耐受性測試，使第2組在測試前禁食16小時，并在測試前4小時皮下給予IOOnmol/ kg VICTOZA'從尾部采集血液，以測量禁食葡萄糖水平，并且測量腹內給予lg/kg葡萄糖 后 15min、30min、60min、90min 和 120min 的血糖水平。
[0246] 第3組（HF DIO誘導且lnmol/kg SEQ ID NO :25-Fc綴合物給藥組）用高脂肪飼 料飼養以誘導肥胖和高血糖，然后一周一次皮下給予lnmol/kg(注射體積5ml/kg)實施例 4制備的SEQ ID NO :25-Fc綴合物。關于血糖耐受性測試，使第3組在測試前禁食24小 時，并在測試前24小時皮下給予lnmol/kg SEQ ID NO :25-Fc綴合物，并禁食16小時。從 尾部采集血液，以測量禁食葡萄糖水平，并且測量腹內給予lg/kg葡萄糖后15min、30min、 60min、90min和120min的血糖水平。
[0247] 將第4組（HF DIO誘導且3nmol/kg SEQ ID NO :25-Fc綴合物給藥組）用高脂肪 飼料飼養以誘導肥胖和高血糖，然后一周一次皮下給予3nmol/kg(注射體積5ml/kg)實施 例4制備的SEQ ID NO :25-Fc綴合物。關于血糖耐受性測試，使第3組在測試前禁食24小 時，并在測試前24小時皮