然后將制得的多種自組裝基元混合用于步驟2)。
[0030] 作為可選方式，步驟1)中所述端基功能化的兩親性樹狀大分子的制備可以采用發 散法或收斂法或發散一收斂相結合的方法。
[0031] 作為可選方式，步驟1)中所述端基功能化的兩親性樹狀大分子中以氨基酸為支化 單元的肽類樹狀大分子的制備方法具體為： a)氨基酸的保護：根據制備樹狀大分子所選用的氨基酸支化單元的不同，對氨基酸的 氨基、胍基和咪唑環進行不同保護基的保護。
[0032] b)制備二代肽類樹狀大分子：按比例稱取含甲酯保護的氨基酸、上述a中含保護 基的氨基酸（3倍當量)、縮合劑（2. 5倍當量)、催化劑（2. 5倍當量）和有機堿（10倍當量)， 在冰浴和氮氣保護條件下，加入溶劑進行脫水縮合反應；然后在室溫下反應48小時，反應 結束后，所得溶液經洗滌，干燥，減壓濃縮，以柱層析分離得到帶有保護基團的二代肽類樹 狀大分子； c) 脫保護：準確稱取二代肽類樹狀大分子，加入重蒸二氯甲烷溶劑溶解，脫保護試劑 三氟乙酸（40倍當量)，在氮氣保護下室溫反應6小時，脫除保護，減壓濃縮，通過萃取或沉 淀，獲得脫去保護的二代肽類樹狀大分子； d) 制備三代肽類樹狀大分子：按比例稱取二代肽類樹狀大分子、上述a中含保護基團 的氨基酸（6倍當量)、縮合劑（5當量)、催化劑（5當量)和有機堿（20當量)，在冰浴和氮氣 保護條件下，加入溶劑進行脫水縮合反應；然后在室溫下反應72小時，反應結束后，所得溶 液經洗滌，干燥，減壓濃縮，以柱層析分離得到帶有保護基團的三代肽類樹狀大分子；重復 以上脫保護和縮合反應步驟，可制備四代肽類樹狀大分子。
[0033]本發明還提供了一種上述程序化多重靶向的樹狀大分子組裝體藥物遞送系統在 制備抗癌藥物中的應用。
[0034]本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥 的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。
[0035] 本發明的有益效果： 1.本發明所述的程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝藥物遞送系統，一方面 利用樹狀分子作為藥物載體所具備的好的穩定性、高的機械強度、多價的末端基團、高支化 結構和仿病毒的胞內遞送等優勢；另一方面利用多元協同自組裝策略整合各個樹狀大分子 自組裝基元自身的優勢便于實現組裝體的多功能化和高效的藥物系統遞送。
[0036] 2.本發明所述的程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝藥物遞送系統，具 有精確的分子結構、豐富的表面官能團，還具有良好的生物相容性和腫瘤治療效果等生物 學性質。
[0037] 3.本發明所述的程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝藥物遞送系統，在 生理pH條件下具有較高的表面負電荷，能有效抵抗血液中蛋白成份吸附，增大血液中循環 時間。
[0038] 4.本發明所述的程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝藥物遞送系統，能 夠組裝成粒徑在100納米到200納米范圍內的藥物載體，有效地通過腫瘤增強的滲透和滯 留效應（EPR效應)，實現對腫瘤部位的被動靶向。
[0039] 5.本發明所述的程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝藥物遞送系統，在 腫瘤微環境中特征生物學信號的響應刺激下（pH值、特定酶的濃度等)，脫除遞送系統中阻 礙入胞的成分(如聚乙二醇、負電基團等)，并曝露出特定功能基團（如正電基團）促進與腫 瘤組織及細胞相互作用，實現對腫瘤微環境靶向（腫瘤外基質靶向）。
[0040] 6.本發明所述的程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝藥物遞送系統，主 動靶向分子或基團的修飾使組裝體與腫瘤細胞膜表面高表達受體特異性結合促進選擇性 識別入胞，實現對腫瘤細胞的進一步主動靶向。
[0041] 7.本發明所述的程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝藥物遞送系統，利 用組裝體外圍修飾的敏感集團的響應性離去暴露出酸緩沖基團（如氨基、胍基和咪唑環)， 能有效緩沖溶酶體內低的PH環境，實現溶酶體逃逸并最終傳遞藥物分子到細胞核發揮治 療作用。
[0042] 8.本發明所述的納米載體系統多元協同自組裝策略為納米載體多能化的實現提 供了一個通用化的平臺，一條簡單易行的途徑。
[0043] 9.本發明所述的程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝藥物遞送系統的設 計為納米載體有效地實現藥物的系統遞送呈現了一條通用化的策略。
[0044]
【附圖說明】： 圖1為本發明實施例1中所述兩親性樹狀大分子自組裝基元一的合成路線圖。
[0045]圖2為本發明實施例1中所述作為對照丁二酸酐修飾的兩親性樹狀大分子的合成 路線圖。
[0046]圖3為本發明實施例2中所述兩親性樹狀大分子自組裝基元二的合成路線圖。
[0047]圖4為本發明實施例1中所述兩親性樹狀大分子自組裝基元一的中間產物和終產 物的質譜和核磁。
[0048]圖5為本發明實施例3中自組裝基元一的臨界聚集濃度測定。
[0049]圖6為本發明實施例6中酸性可調組裝體在不同pH條件下的氨基暴露實驗。
[0050] 圖7為本發明實施例9中通過流式細胞儀確定程序化多重靶向組裝體的最佳成 份比例。
[0051] 圖8為本發明實施例10中程序化多重靶向組裝體酸緩沖能力的測定。
[0052] 圖9為本發明實施例12中程序化多重靶向載藥納米粒子的透射電子顯微鏡圖片。
[0053] 圖10為本發明實施例14中程序化多重靶向載藥納米粒子的體外釋放曲線。
[0054] 圖11為本發明實施例15中程序化多重靶向載藥納米粒子在pH7. 4和6.8下的 細胞毒性測定。
[0055] 圖12為本發明實施例16中通過流式細胞儀實驗定量測定程序化多重靶向載藥納 米粒子的入胞效果。
[0056] 圖13為本發明實施例18中程序化多重靶向組裝體在pH7. 4和6.8下的體外牛 血清蛋白（BSA)吸附實驗。
[0057] 圖14為本發明實施例19中程序化多重靶向藥物遞送系統在BALB/c小鼠體內的 藥代動力學實驗。
[0058] 圖15為本發明實施例21中程序化多重靶向藥物遞送系統對建有4T1腫瘤的 BALB/c小鼠的抗腫瘤效果。
[0059] 圖16為本發明實施例22中對經程序化多重靶向載藥納米粒子治療過的小鼠的 心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織切片進行組織學的分析。
[0060] 圖17為本發明實施例22中對經程序化多重靶向載藥納米粒子治療過的小鼠的腫 瘤組織進行免疫組織化學的分析。
[0061]
【具體實施方式】： 以下通過實施例的【具體實施方式】再對本發明的上述內容作進一步的詳細說明。但不應 當將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。在不脫離本發明的精神和原則之 內做的任何修改，以及根據本領域普通技術知識和慣用手段做出的等同替換或者改進，均 應包括在本發明的保護范圍內。
[0062] 實施例1 :程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子自組裝基元一的制備(合成路線 如圖I) 二代賴氨酸樹狀分子（HO-Lys(G2) -Boc4)的合成 稱取 4.0gH-Lys-OMe.2HC1，14.8gBoc-Lys(Boc)-0H，5.1gHOBT和 13.2g EDOHCl于100mL帶支管的圓底燒瓶中，抽真空，充氮氣保護，加入30mL重蒸DCM，攪 拌溶解，在冰浴下加入28. 3mL的DIEA反應0.5h，然后在室溫下反應48h。水泵旋蒸 除去溶劑，氯仿溶解，依次經IMHCl、飽和NaHCOjPNaCl洗滌后，用無水MgSO4干燥過夜 后，過濾、旋除溶劑，經200-300目硅膠柱層析(洗脫劑DCM/EA= 1:1)分離得到白色粉末 Me〇-Lys(G2)_Boc4 (化合物 1)。
[0063] 脫甲酯保護，準確稱取4. 0g的MeO-Lys(G2) -Boc4在冰浴條件下溶解在NaOH/ MeOH(lM，49. 0mL)溶液中，攪拌0.5h后在室溫下繼續反應6h，旋去甲醇后加入氯仿50 mL溶解殘余物，用鹽酸調節溶液pH在2到3之間，有機相在無水MgS04中過夜干燥，過濾、 旋除溶劑，得到白色粉末HO-Lys(G2)-Boc4(化合物2)。產物無需提純，直接用于下步反應。
[0064] 油胺-谷氨酸（Oleylamine-Glu-H)疏水端的合成 稱取 5. 0g的Boc-Glu-OH，6. 0g的H0BT，15. 5g的EDC?HCl于 100mL帶支管的圓 底燒瓶中，抽真空，充氮氣保護，加入20mL的油胺，入30mL重蒸DCM，攪拌溶解，在冰浴下 加入33. 2mL的DIEA反應0.5h，然后在室溫下反應24h。水泵旋蒸除去溶劑，氯仿溶解， 經飽和NaHCOjPNaCl洗滌后，用無水MgSO4干燥過夜后，過濾、旋除溶劑，經200-300目硅 膠柱層析(洗脫劑DCM/EA= 4:1)分離得到白色固體Oleylamine-Glu-Boc(化合物3)。
[0065] 脫叔丁氧羰基保護，準確稱取3. 5g的Oleylamine-Glu-Boc于100mL帶支管的 圓底燒瓶中，抽真空，充氮氣保護，加入1.2mL的DCM使溶解，在冰浴下加入2. 4mL的TFA， 反應0.5h后在室溫下繼續反應6h，旋去DCM后在油泵下除去TFA，加入乙醚100mL攪拌 過夜，傾去上清液后旋干沉淀，得白色固體Oleylamine-Glu-H(化合物4)。產物無需提純， 直接用于下步反應。
[0066]樹狀大分子（Oleylamine-Glu-Lys(G2)-H4)的合成 準確稱取 3. 0g的HO-Lys(G2) -Boc4, 2. 4g的Oleylamine-Glu-H，2. 9g的PyBop和 0. 6g的HOBT于100mL帶支管的圓底燒瓶中，抽真空，充氮氣保護加入30mLDMF，攪拌 溶解，在冰浴下加入32. 8mL的DIEA反應0.5h，然后在室溫下反應48h。油泵旋蒸除去 溶劑，氯仿溶解，依次經IMHC1、飽和NaHCOjPNaCl洗滌后，用無水MgSO4干燥過夜后， 過濾、旋除溶劑，經200-300目硅膠柱層析(洗脫劑DCM/MeOH= 10:1)分離得到白色固體 Oleylamine-Glu-Lys(G2)-Boc4 (化合物 5)。
[0067]脫叔丁氧羰基保護，準確稱取 3. 0g的Oleylamine-Glu-Lys(G2)-13〇(：4于 100mL 帶支管的圓底燒瓶中，抽真空，充氮氣保護，加入I.ImL的DCM使溶解，在冰浴下加入2. 2 mL的TFA，反應0.5h后在室溫下繼續反應6h，旋去DCM后在油泵下除去TFA，殘留物溶 解在去離子水中，用截留分子量500的透析袋用去離子水透析三天，凍干后得到白色粉末 01eylamine-Glu-Lys(G2)-H4 (化合物6)。產物無需提純，直接用于下步反應。
[0068] 端基功能化的兩親性樹狀大分子（Oleylamine-Glu-Lys(G2)-DMA)的合成 準確稱取1.0g的Oleylamine-Glu-Lys(G2)-H4和2.2g的2, 3-二甲基馬來酸酐于 50mL帶支管的圓底燒瓶中，抽真空，充氮氣保護，加入1. 0mL的DMSO使溶解，冰浴下加入 1.ImL的吡啶和I.ImL的三乙胺，在室溫下反應24h后加入含2. 2g2, 3-二甲基馬來酸 酐的吡啶（1.1mL)和三乙胺的混合液（LImL)，溶液在室溫下繼續反應24h，反應后的溶 液逐滴加入冰的無水乙醚中，沉淀溶解在甲醇中，在4°C條件下pH7. 4的去離子水中透析三 天，透析袋中液體凍干后得到白色固體Oleylamine-Glu-Lys(G2)-DMA(化合物7)，即基元 〇
[0069] 作為對照，丁二酸酐修飾的兩親性樹狀大分子（Oleylamine-Glu-Lys(G2)_SA)的 合成(合成路線如圖2) 準確稱取LOg的Oleylamine-