程序化多重靶向的樹狀大分子組裝體藥物遞送系統及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學材料領域，具體涉及一種程序化多重靶向藥物載體。 技術背景
[0002] 目前，惡性腫瘤嚴重威脅著人類的健康和發展，是全人類面臨的共同難題之一。化 療作為最常用的治療手段之一，實現了對腫瘤一定程度上的抑制；但是，目前化療藥物面臨 的水溶性差、體內代謝和分布不理想、毒副作用大等問題都亟待解決。納米遞送系統在增加 藥物溶解度、改善藥物代謝和降低毒副作用中具有顯著優勢，經過近幾年的研發，一些納米 藥物遞送系統已經成功應用于臨床治療(如，裝載阿霉素的納米脂質體Doxil?，包載紫杉醇 的納米膠束Genexol-PM8等)。在臨床治療中，納米遞送系統仍有諸多問題沒有得到妥善的 解決，特別是如何通過對腫瘤組織及細胞的特異性識別以降低化療過程中毒副作用問題亟 待解決。
[0003] 化學、材料科學與納米技術的發展成為了孕育新型納米載體系統的搖籃；一方面 不斷創造新型的載體系統，另一方面逐步地完善載體的功能。研宄者們先后開發如脂質體、 樹狀大分子、膠束、聚合物囊泡等一系列的納米載體用于抗腫瘤藥物的傳遞。2010年著名化 學科學家VirgilPercec教授在Science上率先報道了雙親性樹狀大分子自組裝體的構建 策略（Science, 2010，328，1009)，美國著名生物材料學家RobertLanger認為這種組裝 體是新近的一代納米載體系統（Nanoletters, 2010，10，3223)。樹狀大分子組裝體相較 于其它納米遞送系統具有高的穩定性和機械強度、豐富的表面官能團、結構生物仿生等特 征。我們研宄組長期致力于完善樹狀大分子組裝體的功能性，開發了新型高效的藥物和基 因遞送系統；為了進一步解決藥物毒副作用的問題，我們希望能夠通過合理的靶向策略提 高納米遞送系統對腫瘤組織的識別，以提高藥物利用度和治療效果并降低毒副作用。
【發明內容】
[0004] 針對上述問題，本發明提供了一種以兩親性樹狀大分子組裝體作為載體的藥物遞 送系統，通過響應腫瘤微環境實現程序化多重靶向，從而攻克藥物載體在體內轉運過程中 遇到的主要生物學障礙并最終把藥物傳遞到目的地。
[0005] 本發明通過以下技術方案來實現： 一種程序化多重靶向的樹狀大分子組裝體藥物遞送系統，所述藥物遞送系統由外層到 內層依次包括：抗蛋白吸附的遮蔽層，正電荷層和/或主動靶向功能層，解組裝功能層；所 述抗蛋白吸附的遮蔽層與正電荷層和/或主動靶向功能層之間通過環境敏感鍵連接，使所 述抗蛋白吸附的遮蔽層包裹在所述正電荷層和/或主動靶向功能層外圍，所述環境敏感鍵 能夠在腫瘤組織的微環境中發生斷裂從而使所述正電荷層和/或主動靶向功能層暴露，所 述解組裝功能層能夠在細胞內發生斷裂使樹狀大分子組裝體解組裝。
[0006] 作為可選方式，所述抗蛋白吸附的遮蔽層包括PEG、肝素鈉、透明質酸、帶負電荷的 親水性基團及寡糖分子等具有抗蛋白吸附功能的基團中的至少一種，其作用是遮蔽在藥物 遞送系統的外圍，有效抵抗血液中蛋白成份吸附和清除作用，增加藥物遞送系統在體內的 循環時間，使其能順利的達到目標部位。
[0007] 作為可選方式，所述正電荷層包括賴氨酸、組氨酸、精氨酸等堿性氨基酸中的至少 一種。進一步的，所述樹狀大分子以賴氨酸、組氨酸、精氨酸中的至少一種作為支化單元，其 最外層的支化單元直接可構成自組裝體中的正電荷層，無需再額外的接枝帶正電荷的基團 進行改性。
[0008] 作為可選方式，所述主動靶向功能層包含但不限于葉酸、生物素或RGD肽等能主 動靶向腫瘤細胞的修飾。進一步的，所述主動靶向功能層可以被包裹在所述抗蛋白吸附的 遮蔽層的內部，也可以與上述抗蛋白吸附的遮蔽層一起裸露在藥物遞送系統的外圍或鑲嵌 在所述抗蛋白吸附的遮蔽層中。
[0009] 作為可選方式，所述環境敏感鍵是指能夠在腫瘤組織的微環境中發生斷裂從而使 抗蛋白吸附的遮蔽層脫落的連接方式。可以是酸敏感基團（馬來酸酐、2_甲基馬來酸酐、2， 3-二甲基馬來酸酐、1，2-二羧基環己烯或2, 2, 3, 3-四甲基馬來酸酐等）或酶敏感底物肽 (如MMP-2、MMP-7或MMP-9等)或溫度敏感基團(如D-A加成鍵)或還原敏感基團(如二硫鍵、 二硒鍵等）中的一種或幾種。進一步的，當采用馬來酸酐、2-甲基馬來酸酐、2,3_二甲基馬 來酸酐、1，2-二羧基環己烯或2, 2, 3, 3-四甲基馬來酸酐等或MMP-2、MMP-7或MMP-9等時 可以將這些基團既作為抗蛋白吸附功能基團又作為連接分子，可以不用再接枝其他抗蛋白 吸附的功能基團。
[0010] 作為可選方式，所述解組裝功能層包括腙鍵、酯鍵、羥醛縮合等易水解鍵，使得自 組裝體的主體結構在胞內容易發生斷裂而實現解組裝，釋放出藥物有效成分。進一步的，所 述自組裝體的自組裝基元的親水端與疏水端之間通過所述易水解鍵連接。
[0011] 作為可選方式，在上述藥物遞送系統中，藥物有效成分可以被包裹在自組裝體內 部，也可以將藥物作為樹狀大分子自組裝基元的組成部分，如將疏水性藥物通過易水解鍵 連接到樹狀大分子中作為自組裝基元的疏水端。
[0012] 作為可選方式，所述藥物遞送系統的粒徑在100納米到200納米范圍內，能夠通過 EPR效應被動靶向到腫瘤部位實現富集。
[0013] 作為可選方式，構成所述藥物遞送系統的樹狀大分子自組裝基元的主體結構為肽 類樹狀大分子。
[0014] 作為可選方式，所述藥物遞送系統由多種帶有不同功能基團的樹狀大分子自組裝 基元混合自組裝而成。
[0015] 本發明還提供了一種樹狀大分子自組裝基元，所述自組裝基元為兩親性的樹狀大 分子，包括親水端和疏水端，所述親水端包括兩層，其內層含有豐富的正電荷基團，用于構 成組裝體的正電荷層，其外層修飾有抗蛋白吸附功能分子，所述抗蛋白吸附功能分子通過 環境敏感鍵連接在所述親水端的外圍，所述環境敏感鍵能夠在腫瘤組織的微環境中發生斷 裂，所述自組裝基元中還包括能夠在細胞內發生斷裂連接件，用于構成組裝體的解組裝功 能層。
[0016] 作為可選方式，在上述自組裝基元中，所述親水端還修飾有主動革El向分子或基團， 如葉酸、生物素或RGD肽中的至少一種，所述主動靶向分子或基團能夠與腫瘤細胞膜表面 高表達受體特異性結合促進組裝體選擇性入胞。
[0017] 通過采用端基功能化的樹狀大分子作為自組裝基元，自組裝基元之間通過親疏水 作用自組裝形成組裝體，通過自組裝基元之間比例的調節來發揮最佳效果。通過所述端基 功能化在所述樹狀大分子的親水端進行主動靶向分子或者刺激（PH，酶等）響應性基團的修 飾，通過多種端基功能化作用使所得的自組裝體具有程序化多重靶向效果。所述程序化多 重靶向是指（1)功能化的樹狀大分子自組裝體表面帶負電荷或抗蛋白吸附基團，有效抵抗 血液中蛋白成份吸附增加體內循環時間，且尺寸在EPR效應范圍內能被動靶向到腫瘤部位 實現富集；（2)腫瘤細胞外環境靶向促使樹狀大分子組裝體外圍敏感集團斷裂離去露出正 電荷層，與細胞膜表面產生靜電作用促進其入胞；（3)外圍修飾的主動靶向分子或基團與 腫瘤細胞膜表面高表達受體特異性結合進一步促進組裝體選擇性入胞；（4)外圍酸緩沖基 團暴露的組裝體可靶向溶酶體并有效緩沖其低的pH環境，實現溶酶體逃逸并在胞內發生 解組裝釋放出藥物有效成分，最終傳遞藥物分子到細胞核發揮治療作用。
[0018] 作為可選，可以在同一個自組裝基元上進行多種端基功能化，也可以將不同端基 功能化的多種自組裝基元進行混合自組裝，通過兩親性樹狀大分子多元協同自組裝策略可 整合各個自組裝基元自身的特性便于實現組裝體的多功能化。
[0019] 作為可選方式，在上述自組裝基元中，所述兩親性樹狀大分子是以氨基酸為重復 單元的一代、二代、三代或四代含肽類樹狀大分子。
[0020] 作為可選方式，構成上述程序化多重靶向的兩親性樹狀大分子組裝體的自組裝 基元的種類可以是1種或1種以上，分別命名為自組裝基元1、自組裝基元2、自組裝基元 3......自組裝基元n(n^ 1)。作為可選方式，所述自組裝基元中至少有一種自組裝基元是 以賴氨酸、組氨酸和精氨酸中的一種或幾種作為支化單元。
[0021] 作為可選方式，所述兩親性樹狀大分子的疏水端為烷基鏈、疏水肽、膽固醇、脂肪 族和芳香族氨基酸重復單元、阿霉素、紫杉醇或喜樹堿中的一種或幾種。
[0022] 作為可選方式，所述兩親性樹狀大分子的主動靶向修飾是以包含但不限于葉酸、 生物素或RGD肽等能主動靶向腫瘤細胞的分子或基團進行修飾。
[0023] 作為可選方式，上述抗蛋白吸附功能分子修飾是通過環境敏感鍵將PEG、肝素鈉、 透明質酸、帶負電荷的親水性基團及寡糖分子等具有抗蛋白吸附功能的基團中的至少一種 修飾到親水端的外圍。所述環境敏感鍵是指能夠在腫瘤組織的微環境中發生斷裂從而使 抗蛋白吸附的遮蔽層脫落的連接方式。可以是酸敏感基團（馬來酸酐、2-甲基馬來酸酐、2， 3-二甲基馬來酸酐、1，2-二羧基環己烯或2, 2, 3, 3-四甲基馬來酸酐等）或酶敏感底物肽 (如MMP-2、MMP-7或MMP-9等)或溫度敏感基團(如D-A加成鍵)或還原敏感基團(如二硫鍵、 二硒鍵等）中的一種或幾種。進一步的，當采用馬來酸酐、2-甲基馬來酸酐、2,3_二甲基馬 來酸酐、1，2-二羧基環己烯或2, 2, 3, 3-四甲基馬來酸酐等或MMP-2、MMP-7或MMP-9等時 可以將這些基團既作為抗蛋白吸附功能基團又作為連接分子，可以不用再接枝其他抗蛋白 吸附的功能基團。
[0024] 作為可選方式，上述自組裝基元的主體結構中含有腙鍵、酯鍵、羥醛縮合等易水解 鍵，使得其在胞內容易發生斷裂而實現解組裝，釋放出藥物有效成分。進一步的，所述自組 裝體的自組裝基元的親水端與疏水端之間通過所述易水解鍵連接。
[0025] 作為可選方式，上述自組裝基元的結構式如下：
其中，作為可選方式，A為堿性氨基酸(如賴氨酸、組氨酸、精氨酸）中的一種或幾種；B為酸性氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸）中的一種或幾種。R1為兩親性樹狀大分子外圍功能化 后的親水端，為主動靶向分子(葉酸、生物素或RGD肽)、酸敏感基團（馬來酸酐、2-甲基馬來 酸酐、2, 3-二甲基馬來酸酐、1，2-二羧基環己烯或2, 2, 3, 3-四甲基馬來酸酐）或酶敏感底 物肽（MMP-2、MMP-7或MMP-9)或溫度敏感基團或還原敏感基團中的一種或幾種，R2代表疏 水端，為烷基鏈、疏水肽、膽固醇、脂肪族或芳香族氨基酸重復單元、阿霉素、紫杉醇或喜樹 堿中的一種或幾種。
[0026] 本發明還提供了一種超分子協同兩親性樹狀大分子自組裝策略，通過親疏水作用 使各個自組裝基元共同組裝，整合各個自組裝基元的特性協同實現組裝體的多功能化。
[0027] 作為可選方式，在上述兩親性樹狀大分子組裝體中，所述協同自組裝基元可以是1 種或多種。
[0028] 本發明還提供了一種上述程序化多重靶向的樹狀大分子組裝體藥物遞送系統的 制備方法，包括以下步驟如下： 1) 制備端基功能化的兩親性樹狀大分子自組裝基元； 2) 將自組裝基元按照一定比例溶解在共溶劑中，在超聲條件下充分混合，并在超聲的 條件下將上述溶液緩慢地滴加入去離子水中，通過親疏水作用實現共組裝； 3) 通過透析除去有機溶劑，再經過冷凍干燥，制得兩親性樹狀大分子自組裝粒子； 4) 將上述兩親性樹狀大分子自組裝粒子及疏水性藥物按照一定質量比溶解在共溶劑 中，在超聲條件下充分混合，并在超聲的條件下將上述溶液緩慢地滴加入去離子水中，形成 包裹藥物的自組裝體載藥系統。
[0029] 作為可選方式，在上述的制備方法的步驟1)中，在同一自組裝基元上進行多種端 基功能化修飾制得一種自組裝基元或者分別在不同的自組裝基元上分別進行端基功能化 修飾