(4) 溶液用孔徑IOOnm的超濾機超濾處理，壓力0. 5MPa，溫度為常溫，收集含有相應分 子量的斑蝥蛆蟲蛋白質超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用60%乙腈活化預處理，加0. 08%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用1〇~80%的乙腈梯度脫洗，流速 8mL/min，收集相關梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水(體積比1. 25:3. 75:5)溶劑體系中，用超 聲駐波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率2. 0KW，頻率lOOOKHz，流速 300mL/min，紫外檢測器波長280nm ; (7) 純化后的斑蝥蛆蟲蛋白質用真空冷凍干燥機在溫度-30~50°C、時間18h干燥制備 成凍干蛋白粉。
[0034] 實施例5: 取斑蝥蛆蟲凍干蛋白粉100~150g、卵磷脂l~15g、液體石蠟200~350g，將三者攪拌均 勻，用研磨機以30~60r/min研勻成糊狀，另取烏桕脂100~200g在水浴上加熱40~60°C熔化 后，冷卻至25~38°C，倒入研勻的斑蝥蛆蟲蛋白質-卵磷脂-液體石蠟混合物中迅速攪拌均 勻，趁熱澆注于栓劑模具中，冷凝到10~20°C，從栓劑模具中取出即為成型的斑蝥蛆蟲蛋白 質栓劑，整理光滑后包裝成品。
[0035] 實施例6: 取斑蝥蛆蟲凍干蛋白粉120g、卵磷脂10g、液體石蠟250g，將三者攪拌均勻，用研磨機 以60r/min研勻成糊狀，另取烏桕脂150g在水浴上加熱60°C熔化后，冷卻至30°C，倒入研 勻的斑蝥蛆蟲蛋白質-卵磷脂-液體石蠟混合物中迅速攪拌均勻，趁熱澆注于栓劑模具中， 冷凝到15°C，從栓劑模具中取出即為成型的斑蝥蛆蟲蛋白質栓劑，整理光滑后包裝成品。
[0036] 實施例7: 脂質體注射劑制備： (I)Imol磷脂酰絲氨酸用玻璃平面成型法制成薄膜后，加入1000~3000L生理鹽水水合 處理，再用超聲波在頻率500~2000KHz、功率0. 01~5KW處理l~5min。
[0037] (2)取上述溶液 l~100mL 加入到含量 0? 001~0.0 lmol/L 的 0? l~1000mLCaCl2溶液 中，在轉速30~75r/min條件下攪拌10~30min，然后在25~50°C條件下靜置30~120min。
[0038] (3)將生成物放置離心機中，在轉速1500~3000r/min離心分離5~30min，將離 心物從離心機中取出后加入2~50g斑蝥蛆蟲蛋白質混合均勻，在10~25°C條件下靜置 10~120min。
[0039] (4)上述物體加入含有0. 01~10mol/L的乙二胺四乙酸的生理鹽水溶液0. 1~10L 中，混合均勻靜置30~180min，得到單層脂質體。
[0040] (5)取l~10mg單層脂質體與10~200mL生理鹽水溶液混合，制備成為注射劑。
[0041] 實施例8: 脂質體注射劑制備： (I)Imol磷脂酰絲氨酸用玻璃平面成型法制成薄膜后，加入2000L生理鹽水水合處理， 再用超聲波在頻率1000 KHz、功率2KW處理5min。
[0042] (2)取上述溶液50mL加入到含量0? 005mol/L的1000 mLCaCl2溶液中，在轉速45r/ min條件下攪拌30min，然后在30°C條件下靜置60min。
[0043] (3)將生成物放置離心機中，在轉速2000r/min離心分離20min，將離心物從離心 機中取出后加入20g斑蜜蛆蟲蛋白質混合均勾，在15°C條件下靜置60min。
[0044] (4)上述物體加入含有lmol/L的乙二胺四乙酸的生理鹽水溶液5L中，混合均勻靜 置80min，得到單層脂質體。
[0045] (5)取5mg單層脂質體與IOOmL生理鹽水溶液混合，制備成為注射劑。
[0046] 實施例9: 腸溶膠囊的制備： 取10~100g斑蝥蛆蟲蛋白質、500~2000g預凝膠淀粉及5-50g乳糖充分混合，填充入羥 丙基甲基纖維素腸溶膠囊中制備成為斑蝥蛆蟲蛋白質腸溶膠囊。
[0047] 實施例10: 腸溶膠囊的制備： 取50g斑蝥蛆蟲蛋白質、1000 g預凝膠淀粉及30g乳糖充分混合，填充入羥丙基甲基纖 維素腸溶膠囊中制備成為斑蝥蛆蟲蛋白質腸溶膠囊。
[0048] 實施例11: 外用軟膏劑的制備： 取10~20g斑蝥蛆蟲蛋白質置于滅菌研缽中，加入預先用120~150°C干熱滅菌30~60min 并放冷的10~20mL液體石賭，研磨成糊狀，再加入預先用150~160°C干熱滅菌60~90min并 放冷的2~5g凡士林研勻，即得軟膏劑。
[0049] 實施例12: 外用軟膏劑的制備： 取150g斑蝥蛆蟲蛋白質置于滅菌研缽中，加入預先用130°C干熱滅菌40min并放冷的 15mL液體石賭，研磨成糊狀，再加入預先用155°C干熱滅菌80min并放冷的4g凡士林研勾， 即得軟膏劑 實施例13: 膀胱癌疾病分期： 0期：癌灶局限于粘膜層，無淋巴結轉移； I期：腫瘤局限于固有肌層以內，無淋巴結轉移； II期：腫瘤浸潤超過固有肌層，但無淋巴結轉移； III期：淋巴結轉移； IV期：遠處轉移(腦、肝、肺等）或腹膜轉移。
[0050]治療方法： 患者需嚴格戒掉煙、酒、辛辣食物，患者按體重70Kg計，每天注射脂質體藥劑1次，每次 300呢；或每天服用腸溶膠囊2次，每次3粒；或栓劑治療，每日1次，每次1支；或外用軟膏 劑，每天3次，每次0. 2g。
[0051]治療結果分級標準： I、近期療效（40天末與治療前比較） (1) 完全緩解：病灶完全消失，無新的病灶出現； (2) 部分緩解：病灶縮小到治療前的50%或更小，無新的病灶出現，多灶性病變時沒有 一個病灶增大； (3) 穩定期：$:輕度緩解：病灶縮小面積30%或增大面積25%，自覺癥狀改善，體力基本 狀況上升；::?基本穩定：病灶縮小不到25%或增大面積不超過25%以上，自覺癥狀改善，體 力基本狀況上升。
[0052](4)擴展：單個面積或多個病灶總面積比治療前增大25%以上或出現新的病變，臨 床癥狀加重，體力基本狀況下降。
[0053] 11、中期療效（7周~1年） (1) 完全緩解：無瘤生存； (2) 部分緩解：1:癌體回變到治療前的面積50%以上，或出現新的病灶；.癌體無增大 或縮小，病癥改善或消失；:f體力基本狀況上升。
[0054](3)轉移或擴展：病原灶擴大發展，出現新的轉移灶，臨床癥狀加重，體力狀況下 降。
[0055]III、遠期療效（1~5年） (1) 無瘤生存； (2) 帶瘤生存； (3) 死亡。
[0056] 治療結果：
【主權項】
1. 一種斑蝥蛆蟲蛋白質在制備抗膀胱癌藥品中的應用。
2. 根據權利要求1所述的斑蝥蛆蟲蛋白質在制備抗膀胱癌藥品中的應用，其特征在于 所述斑蝥蛆蟲蛋白質的制備步驟如下： (1) 將1000 g斑蝥蛆蟲在常溫膨化裝置中常溫條件下膨化粉碎； (2) 膨化粉碎后的物料加入到膨脹溶劑體系提取裝置中，加入由l~10Kg液態二氧化 碳、100~500mL甲醇及100~300gNH 3 ? H2O組成或由l~10Kg液態二氧化碳、100~500mL乙醇 及100~300g氯化銨組成的膨脹溶劑并加壓至2~10MPa，形成膨脹溶劑體系，提取出斑蝥蛆 蟲蛋白質粗品； (3) 收集含有斑蝥蛆蟲蛋白質粗品的溶液并且用微孔過濾器過濾去掉雜質； (4) 用超濾機超濾處理，收集斑蝥蛆蟲蛋白質超濾溶液； (5) 超濾液溶解在乙腈中用固相萃取柱分離，收集洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在由正丁醇-乙酸乙酯-水按體積比1. 25:3. 75:5組成或由聚乙 二醇-葡聚糖T500按重量比4. 5:7組成的溶劑體系中，用超聲駐波液相制備色譜分離純 化； (7) 純化后的斑蝥蛆蟲蛋白質用真空冷凍干燥機制備成凍干蛋白粉。
3. 根據權利要求1所述的斑蝥蛆蟲蛋白質在制備抗膀胱癌藥品中的應用，其特征在于 所述抗膀胱癌藥品的劑型為栓劑，制備方法如下： 取斑蝥蛆蟲凍干蛋白粉100~150g、卵磷脂l~15g、液體石蠟200~350g，將三者攪拌均 勻，用研磨機以30~60r/min研勻成糊狀，另取烏桕脂100~200g在水浴上加熱40~60°C熔化 后，冷卻至25~38°C，倒入研勻的斑蝥蛆蟲蛋白質-卵磷脂-液體石蠟混合物中迅速攪拌均 勻，趁熱澆注于栓劑模具中，冷凝到10~20°C，從栓劑模具中取出即為成型的斑蝥蛆蟲蛋白 質栓劑。
4. 根據權利要求1所述的斑蝥蛆蟲蛋白質在制備抗膀胱癌藥品中的應用，其特征在于 所述抗膀胱癌藥品的劑型為脂質體注射劑，制備方法如下： (1) Imol磷脂酰絲氨酸用玻璃平面成型法制成薄膜后，加入1000~3000L生理鹽水水合 處理，再用超聲波在頻率500~2000KHz、功率0. 01~5KW處理l~5min ; (2) 取上述溶液l~100mL加入到含量0. 001~0. 01mol/L的0. l~1000mLCaCl2溶液中，在 轉速30~75r/min條件下攪拌10~30min，然后在25~50°C條件下靜置30~120min ; (3) 將生成物放置離心機中，在轉速1500~3000r/min離心分離5~30min，將離心物從離 心機中取出后加入2~50g斑蝥蛆蟲蛋白質混合均勻，在10~25°C條件下靜置10~120min ; (4) 上述物體加入含有0. 01~10mol/L的乙二胺四乙酸的生理鹽水溶液0. 1~10L中，混 合均勻靜置30~180min，得到單層脂質體； (5) 取l~10mg單層脂質體與10~200mL生理鹽水溶液混合，制備成為注射劑。
5. 根據權利要求1所述的斑蝥蛆蟲蛋白質在制備抗膀胱癌藥品中的應用，其特征在于 所述抗膀胱癌藥品的劑型為腸溶膠囊，制備方法如下： 取10~100g斑蝥蛆蟲蛋白質、500~2000g預凝膠淀粉及5-50g乳糖充分混合，填充入羥 丙基甲基纖維素腸溶膠囊中，制備成為斑蝥蛆蟲蛋白質腸溶膠囊。
6. 根據權利要求1所述的斑蝥蛆蟲蛋白質在制備抗膀胱癌藥品中的應用，其特征在于 所述抗膀胱癌藥品的劑型為外用軟膏劑，制備方法如下： 取10~20g斑蝥蛆蟲蛋白質置于滅菌研缽中，加入預先用120~150°C干熱滅菌30~60min 并放冷的10~20mL液體石賭，研磨成糊狀，再加入預先用150~160°C干熱滅菌60~90min并 放冷的2~5g凡士林研勻，即得軟膏劑。
【專利摘要】本發明公開了一種斑蝥蛆蟲蛋白質在制備抗膀胱癌藥品中的應用，所述制備方法如下：將斑蝥蛆蟲在常溫膨化裝置中膨化粉碎；然后加入到膨脹溶劑體系提取裝置中提取出斑蝥蛆蟲蛋白質粗品；收集含有斑蝥蛆蟲蛋白質粗品的溶液并用微孔過濾器過濾去掉雜質；用超濾機超濾處理，收集斑蝥蛆蟲蛋白質超濾溶液；超濾液溶解在乙腈中用固相萃取柱分離，收集洗脫成分；將洗脫成分溶解在溶劑體系中，用超聲駐波液相制備色譜分離純化；用真空冷凍干燥機制備成凍干蛋白粉，可用于制備抗膀胱癌藥品。本發明制備的斑蝥蛆蟲蛋白質制劑質量穩定，結構清楚，藥理明晰，療效明顯，含量可檢可測，劑型多樣，成本較低，適合工業化生產。
【IPC分類】A61P35-00, C07K1-16, A61K38-00, C07K1-34, A61K35-64, C07K1-36
【公開號】CN104740592
【申請號】CN201510092237
【發明人】徐華民, 趙榮華
【申請人】哈爾濱工業大學
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月2日