斑蝥蛆蟲蛋白質在制備抗膀胱癌藥品中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種斑蝥蛆蟲蛋白質的新用途，尤其是斑蝥蛆蟲蛋白質在制備抗膀胱 癌藥品中的應用。
【背景技術】
[0002] 膀胱癌是指發生于膀胱壁的惡性腫瘤，是泌尿系統常見的腫瘤，膀胱癌可分為兩 大類：（1)在間葉組織發生的腫瘤(淋巴瘤、肉瘤、類癌等）；（2)在上皮組織發生的腫瘤(膀 胱移行上皮癌、鱗狀上皮癌及腺癌)。
[0003] 現在一般認為膀胱癌的病因與下列因素有關：（1)環境因素，長期接觸芳香族有 機化合物、橡膠、制革、染料、油漆、造紙、紡織等行業人群；（2)吸煙族人群；（3)藥物副作用 影響；（4)慢性膀胱炎、結石、血吸蟲；（5)體內色氨酸的代謝異常。
[0004] CN103857796A公開了膀胱癌細胞的檢測方法，用于膀胱癌細胞的檢測方法的引物 及膀胱癌標記物。該發明提供一種對膀胱癌的特異度高且能夠檢測出惡性度低的膀胱癌組 織的檢測方法及膀胱癌標記物。
[0005] CN103975078A公開了治療和診斷膀胱癌的方法和組合物，該發明提供用于檢測和 治療膀胱癌的方法、組合物和試劑盒。
[0006] CN103857796A公開了治療膀胱癌的方法，該發明通過施用包括納米顆粒的組合物 提供用于治療包括轉移性膀胱癌和非肌肉浸潤性膀胱癌在內的方法和組合物。所述的納米 顆粒包括紫衫烷和白蛋白制備而成。
[0007] CN103800842A公開了一種治療膀胱癌的中藥組合物，該組合物由金銀花、半枝蓮、 肉桂、木通、澤瀉、牡丹皮、當歸、黃柏、莪術、山藥等27種中草藥組成，藥效具有協同作用。
[0008] CN102372773A公開了人膀胱癌腫瘤標志物及其抗體和應用，該發明中的人膀胱癌 腫瘤標志物為異常糖基化的整合素和產生的單克隆抗體的雜交瘤細胞及其分泌的單克隆 抗體。
[0009] CN103908581A公開了一種治療膀胱癌的藥物及制備方法，該發明的藥物由浮萍、 長桿蘭、苦菜、滑石、石葦、車前草、木通和磨盤草等16種中草藥組成。
[0010] CN102793725B公開了人工培育斑蝥蛆蟲的工藝，本工藝充分利用昆蟲生長特性、 生物學特性，批量培育生成奇特成分的昆蟲，這種成分是一種專門抗膀胱癌的蛋白質。
【發明內容】
[0011] 本發明的目的是提供一種斑蝥蛆蟲蛋白質在制備抗膀胱癌藥品中的應用，本發明 工藝過程中采用適宜的方法提取分離斑蝥蛆蟲蛋白質，并根據斑蝥蛆蟲蛋白質的特性輔以 相應的材料至制備成不同劑型的藥劑。
[0012] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的： (1)將1000 g斑蝥蛆蟲在常溫膨化裝置（200520108339. X)中常溫條件下膨化粉碎。
[0013] 本步驟中，所述膨化壓力為0?l~5MPa，時間為10~60min。
[0014] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中，加入 膨脹溶劑并加壓至2~10MPa，形成膨脹溶劑體系，提取出斑蝥蛆蟲蛋白質粗品。
[0015] 本步驟中，所述膨脹溶劑由l~10Kg液態二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH 3 ? H2O組成或由l~10Kg液態二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化銨組 成。
[0016] 本步驟中，所述提取溫度為10~20°C，時間為10~30min。
[0017] (3)收集含有斑蝥蛆蟲蛋白質粗品的溶液并且用微孔過濾器過濾去掉雜質。
[0018] 本步驟中，所述微孔過濾器的孔徑為0. 5~50Mm。
[0019] (4)用超濾機超濾處理，收集含有相應分子量的斑蝥蛆蟲蛋白質超濾溶液。
[0020] 本步驟中，所述超濾機的孔徑為50~100nm。
[0021] (5)超濾液溶解在適宜的溶劑中用固相萃取柱分離，收集洗脫成分。
[0022] 本步驟中，所述溶劑為乙腈。
[0023] (6)將洗脫成分溶解在合適的溶劑體系中，用超聲駐波液相制備色譜 (200920274485. 8)分離純化。
[0024] 本步驟中，所述溶劑體系由正丁醇-乙酸乙酯-水(體積比1. 25:3. 75:5)組成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）組成。
[0025] (7)純化后的斑蝥蛆蟲蛋白質用真空冷凍干燥機制備成凍干蛋白粉。
[0026] 本步驟中，所述真空冷凍干燥溫度為_30~50°C、時間為18~26h。
[0027] (8)賦予不同的藥用輔助材料，分別制備成注射劑、口服劑、栓劑等，可用于制備抗 膀胱癌藥品。
[0028] 本發明的優點和有益效果如下：通過本發明分離純化的斑蝥蛆蟲蛋白質 用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法及葡聚糖凝膠G-75凝膠過濾法測得相對分子量為 11. 8~12. 6KPa;用等電聚焦法測定其等電點為pH9. 6~10. 7;常規化學法分析結果表明其不 含糖類和磷酸基團；紫外分光光度法分析在260nm和280nm測定純化的斑蜜蛆蟲蛋白質含 量為98. 2%;分子結構屬非典型、非單一的昆蟲蛋白質，鏈內與鏈間不含二硫鍵，其三級結 構構象單元以無規卷曲為主，a螺旋與e折疊的含量比例基本相當。本發明制備的斑蝥 蛆蟲蛋白質制劑質量穩定，結構清楚，藥理明晰，療效明顯，含量可檢可測，劑型多樣，成本 較低，適合工業化生產。
【具體實施方式】
[0029] 下面結合實施例對本發明的技術方案作進一步的說明，但并不局限如此，凡是對 本發明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，均應涵 蓋在本發明的保護范圍中。
[0030] 實施例1: (1) 將1000 g斑蝥蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對膨化裝置內 充入二氧化碳氣體并加壓至〇. l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，斑蜜蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的斑蝥蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液態二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 ? H2O,加壓至2~10MPa，形成膨 脹溶劑體系，保持溫度l〇~20°C，時間10~30min，斑蝥蛆蟲粉體中的蛋白質溶解，然后降壓 至常壓，生成斑蝥蛆蟲蛋白質粗品與甲醇-NH3 ? H2O的混合液； (3) 收集含有斑蝥蛆蟲蛋白質粗品的溶液，用孔徑0. 5~50Mm的微孔過濾器過濾去處固 體雜質； (4) 溶液用孔徑50~100nm的超濾機超濾處理，壓力0. 3~0. 8MPa，溫度為常溫，收集含有 相應分子量的斑蝥蛆蟲蛋白質超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化預處理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用10~80%的 乙腈梯度脫洗，流速l~l〇mL/min，收集相關梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶劑體系中，用超聲駐 波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率0. 2~3. 0KW，頻率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外檢測器波長260~280nm ; (7) 純化后的斑蝥蛆蟲蛋白質用真空冷凍干燥機在溫度-30~501：、時間18~2611干燥制 備成凍干蛋白粉。
[0031] 實施例2: (1) 將1000 g斑蝥蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對膨化裝置內 充入二氧化碳氣體并加壓至〇. l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，斑蜜蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的斑蝥蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入5Kg液態二氧化碳、300mL甲醇及200gNH3 ? H2O,加壓至5MPa，形成膨脹溶劑體系，保持 溫度15°C，時間20min，斑蝥蛆蟲粉體中的蛋白質溶解，然后降壓至常壓，生成斑蝥蛆蟲蛋 白質粗品與甲醇-NH 3 ? H2O的混合液； (3) 收集含有斑蝥蛆蟲蛋白質粗品的溶液，用孔徑30Mm的微孔過濾器過濾去處固體雜 質； (4) 溶液用孔徑IOOnm的超濾機超濾處理，壓力0. 5MPa，溫度為常溫，收集含有相應分 子量的斑蝥蛆蟲蛋白質超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用80%乙腈活化預處理，加0. 05%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用1〇~80%的乙腈梯度脫洗，流速 5mL/min，收集相關梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶劑體系中，用超聲駐 波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率I. 0KW，頻率500KHz，流速200mL/ min，紫外檢測器波長260nm ; (7) 純化后的斑蝥蛆蟲蛋白質用真空冷凍干燥機在溫度-30~40°C、時間20h干燥制備 成凍干蛋白粉。
[0032] 實施例3: (1) 將1000 g斑蝥蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對膨化裝置內 充入二氧化碳氣體并加壓至〇. l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，斑蜜蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的斑蝥蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液態二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化銨，加壓至2~10MPa，形成膨脹 溶劑體系，保持溫度l〇~20°C，時間10~30min，斑蝥蛆蟲粉體中的蛋白質溶解，然后降壓至 常壓，生成斑蝥蛆蟲蛋白質粗品與乙醇-氯化銨的混合液； (3) 收集含有斑蝥蛆蟲蛋白質粗品的溶液，用孔徑0. 5~50Mm的微孔過濾器過濾去處固 體雜質； (4) 溶液用孔徑50~100nm的超濾機超濾處理，壓力0. 3~0. 8MPa，溫度為常溫，收集含有 相應分子量的斑蝥蛆蟲蛋白質超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化預處理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用10~80%的 乙腈梯度脫洗，流速l~l〇mL/min，收集相關梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水(體積比1. 25:3. 75:5)溶劑體系中， 用超聲駐波液相制備色譜（200920274485. 8 )分離純化，超聲波功率0. 2~3. 0KW，頻率 500~1000KHz，流速 50~500mL/min，紫外檢測器波長 260~280nm ; (7) 純化后的斑蝥蛆蟲蛋白質用真空冷凍干燥機在溫度-30~501：、時間18~2611干燥制 備成凍干蛋白粉。
[0033] 實施例4: (1) 將1000 g斑蝥蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對膨化裝置內 充入二氧化碳氣體并加壓至2MPa，時間40min，然后迅速釋放壓力至常壓，斑蝥蛆蟲被膨化 成粉體； (2) 膨化粉碎后的斑蝥蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入6Kg液態二氧化碳、200mL乙醇及150g氯化銨，加壓至6MPa，形成膨脹溶劑體系，保持 溫度20°C，時間lOmin，斑蝥蛆蟲粉體中的蛋白質溶解，然后降壓至常壓，生成斑蝥蛆蟲蛋 白質粗品與乙醇-氯化銨的混合液； (3) 收集含有斑蝥蛆蟲蛋白質粗品的溶液，用孔徑50Mm的微孔過濾器過濾去處固體雜 質；