抗腫瘤藥物組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及新的抗腫瘤藥物組合物，其可用于治療由異常的VEGFR、roGFR、raf、 p38、和/或flt-3激酶信號介導的疾病和疾病癥狀。
【背景技術】
[0002] ras信號轉導途徑的激活意味著對細胞增殖、分化和轉化具有深遠影響的事件的 級聯反應。作為Ras下游效應子的Raf激酶是將這些信號從細胞表面受體傳遞到細胞核的 一個關鍵遞質。已經證明，通過使用raf激酶的滅活抗體或顯性失活raf激酶或顯性失活 MEK (raf激酶的底物）的共表達抑制raf激酶信號途徑而抑制活化ras的作用會導致轉化 的細胞恢復為正常的生長表型。Kolch等進一步證明了通過反義RNA對raf表達的抑制阻 斷了膜相關致癌基因引起的細胞增殖。同樣地，在試管實驗和體內實驗中已經證實raf激 酶的抑制（通過反義寡核苷酸）與多種人類腫瘤類型的生長抑制是相關的。
[0003] 維持大小超過l_2mm3的腫瘤細胞的持續腫瘤生長需要功能性間質，這是包括成 纖維細胞、平滑肌細胞、內皮細胞、細胞外基質蛋白質和可溶因子的支持結構。腫瘤通過分 泌諸如TOGF和轉化生長因子β (TGF-β)等可溶性生長因子引起間質組織的形成，所述生 長因子各自刺激宿主細胞分泌諸如成纖維細胞生長因子（FGF)、表皮生長因子（EGF)和血 管內皮生長因子（VEGF)等互補因子。這些刺激因子引起新的血管生成，這向腫瘤提供氧和 營養物質并使其生長以及為腫瘤轉移提供路線。相信針對抑制間質形成的一些治療方法會 對源自多種組織學類型的上皮腫瘤的生長加以抑制。然而，由于其性質的復雜性以及多種 生長因子參與血管生成過程和腫瘤惡化，一種針對單一信號途徑的物質可能僅有有限的功 效。希望能對腫瘤在宿主間質中用于引發血管生成的多個關鍵信號途徑提供治療方法。這 些途徑包括I 3DGF (間質形成的有效刺激因子）、FGF (成纖維細胞和內皮細胞的化學趨化因 子和促有絲分裂素）和VEGF(血管形成的有效調節因子）。
[0004] TOGF是間質形成的一種關鍵調節因子，它由多種腫瘤以旁分泌形式分泌并促進成 纖維細胞、平滑肌及內皮細胞的生長，從而促進間質形成及血管生成。TOGF最初是作為猿 猴肉瘤病毒的v-sis致癌基因產物得以鑒定。該生長因子由被稱為A鏈或B鏈的2條肽鏈 構成，肽鏈一級氨基酸序列具有60 %的同源性。肽鏈經二硫鍵相連形成由AA、BB或AB同 源或異源二聚體組成的30kDa的成熟蛋白。在血小板中發現了高水平的TOGF，并且TOGF 可由內皮細胞和血管平滑肌細胞表達。此外，在諸如血管形成不足的腫瘤組織中所發現的 低氧條件下I3DGF的產生得以上調。TOGF以高親和力與TOGF受體（PDGFR)結合，該受體 是1106個氨基酸構成的124kDa的跨膜酪氨酸激酶受體。TOGFR是同源或異源二聚體肽 鏈形式的，肽鏈在其氨基酸序列上總地具有30%的同源性，并且在其激酶結構域之間具有 64%的同源性。TOGFR是具有分開的激酶結構域的酪氨酸激酶受體家族的成員，該家族包 括VEGFR2 (KDR)、VEGFR-3 (flt-4)、c-Kit和f lt-3。TOGFR主要在成纖維細胞、平滑肌細胞 和周細胞（pericyte)上表達，并在神經細胞、腎小球細胞、Leydig細胞和中樞神經系統的 Schwann細胞上少量表達。一旦與受體結合，F1DGF引起受體二聚化并經歷酪氨酸殘基的自 我磷酸化和相互磷酸化，這能提高受體的激酶活性并促進下游效應因子通過激活SH2蛋白 結合結構域的募集。包括PI-3激酶、磷酯酶C-γ、src和GAP (針對p21-ras的三磷酸鳥 苷酸酶激活蛋白）在內的多種信號分子與激活的TOGFR形成復合物。通過激活PI-3激酶， I3DGF激活Rho細胞途徑從而引起細胞運動和迀移，并通過激活GAP引起通過p21-ras和 MAPK信號途徑激活的有絲分裂。
[0005] 在成人中，TOGF的主要作用是促進并提高傷口愈合的速度并保持血管的體內平 衡。在血小板中發現了高濃度的roGF，它對于成纖維細胞、平滑肌細胞、嗜中性粒細胞和巨 噬細胞而言是一種有效的化學趨化因子。除了其在傷口愈合中的作用之外，PDGF幫助保持 血管的體內平衡。在新生血管發育過程中，PDGF募集血管結構完整性所需要的周細胞和平 滑肌細胞。TOGF被認為在腫瘤新生血管形成中發揮相似的作用。作為其在血管生成中所起 作用的一部分，PDGF通過其對結締組織細胞和細胞外基質之間相互作用的調節調節血管的 滲透性而控制組織間隙的流體壓力。抑制TOGFR的活性可以降低組織間隙的壓力并促進細 胞毒素流入腫瘤而提高這些物質的抗腫瘤功效。
[0006] I3DGF可以通過旁分泌或自分泌直接刺激間質細胞或腫瘤細胞上的TOGFR或通過 受體的信號放大或經重組激活受體而促進腫瘤生長。過表達的TOGF可以使人的黑素瘤細 胞和角質化細胞這兩種不表達I3DGF受體的細胞類型可能通過TOGF對間質形成和誘導血管 生成的直接作用而發生轉化。在其中腫瘤表達I 3DGF但不表達受體的結腸癌、肺癌、乳癌和 前列腺癌等腫瘤中也觀察到了這種腫瘤間質的旁分泌刺激。在神經膠母細胞瘤、軟組織瘤、 卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌和肺癌中已經報道了對腫瘤細胞生長的自分泌刺激，其中大部分 經分析的腫瘤細胞表達TOGF配體和受體。非配體依賴型的受體激活發現地較少，但在慢性 粒單核細胞白血病（CMML)中已有報道，其中a染色體易位在類Ets轉錄因子TEL和TOGF受 體之間形成融合蛋白。此外，在胃腸道間質瘤中已經發現了與c-Kit激活無關的TOGFR中 的激活突變。TOGFR抑制劑能干擾腫瘤間質發育并抑制腫瘤生長和轉移而沒有過度的副作 用。
[0007] 血管內皮生長因子（VEGF，也被稱為血管滲透性因子VPF)是另一種在胚胎發育和 有些血管生成依賴的疾病中血管新生和血管發生的主要調節因子。VEGF代表由于選擇性 RNA剪接而以同源二聚體形式存在的促有絲分裂原異構體家族。VEGF異構體對于血管內皮 細胞來說是高度特異的。
[0008] VEGF表達受缺氧以及諸如白介素1、白介素6、表皮生長因子和轉化生長因子等 多種細胞因子和生長因子誘導。目前已經報道，VEGF和VEGF家族成員與以下三種跨膜受 體酪氨酸激酶中的一種或多種結合：VEGF受體1 (也稱為fIt-I (類fms酪氨酸激酶1))、 VEGFR-2 (也稱為含激酶插入結構域受體（KDR)，KDR的小鼠類似物稱作胎肝激酶I (f Ik-I)) 和VEGFR-3 (也稱為f lt-4)。已經證實，VEGFR-2和f It-I具有不同的信號轉導性質。因此， VEGFR-2在完整細胞中經歷配體依賴的強酪氨酸磷酸化，而fIt-I表現出弱應答。因此，相 信對于誘導全范圍的VEGF介導的生物學應答而言，與VEGFR-2結合是關鍵要求。
[0009] VEGF在體內血管發生中發揮中心作用，并引起血管新生和血管滲透化。不加調節 的VEGF表達引發多種疾病，其特征是不正常的血管新生和/或高滲透性作用。相信有些物 質對VEGF介導的信號轉導級聯的調節能對不正常的血管新生和/或高滲透性作用提供有 效控制。腫瘤低氧區域內的腫瘤化細胞通過刺激VEGF生產作出反應，這引起沉默的內皮細 胞的激活以刺激新的血管形成。此外，在沒有血管新生的腫瘤區域中的VEGF產生可以推動 ras信號轉導途徑。原位雜交研宄表明，在包括肺癌、甲狀腺癌、乳癌、胃腸道腫瘤、腎及膀胱 腫瘤、卵巢癌、宮頸癌以及血管瘤和幾種顱內腫瘤在內的各種人類腫瘤中VEGF mRNA的顯著 上調。中和性VEGFR-2單克隆抗體在阻斷腫瘤血管新生中被證明是有效的。
[0010] VEGF的過表達（例如在極端缺氧條件下）可以引起眼球內血管新生，導致血管過 量增生，最終導致失明。已經在包括糖尿病視網膜病、缺血性視網膜靜脈閉塞和早產兒視網 膜病和老年黃斑病變在內的多種視網膜病中觀察到了這樣的級聯反應。
[0011] 在風濕性關節炎（RA)中，血管生成因子的產生可以介導血管翳的內向生長。RA 患者的滑液中具有高水平的免疫反應性VEGF，而在其他形式關節炎或退化性關節疾病患 者的滑液中VEGF水平低下。在大鼠膠原誘導型關節炎模型中已經證實，血管生成抑制劑 AGM-170阻礙關節中的新血管形成。
[0012] 在銀肩病以及諸如大皰性類天皰瘡、多形紅斑和皰瘆樣皮炎等與表皮下皰瘆形成 相關的皰瘆類疾病中也表現出VEGF表達的提高。
[0013] 血管內皮生長因子（VEGF、VEGF-C、VEGF-D)及其受體（VEGFR2、VEGFR3)不僅是腫 瘤血管生成、而且是淋巴管生成的關鍵調控因子。VEGF、VEGF-C和VEGF-D在大部分腫瘤中 主要在腫瘤生長期間并經常以充分提高的水平表達。VEGF表達受缺氧、細胞因子、諸如ras 的致癌基因或通過腫瘤抑制基因的滅活的刺激。
[0014] VEGF的生物學活性通過與其受體的結合得以介導。VEGFR3(也稱為flt-4)主要 在正常成人組織中的淋巴管內皮細胞上表達。對于新的淋巴管形成需要VEGFR3功能，但 對于維持已存在的淋巴管則不需要。VEGFR3在腫瘤的血管內皮細胞上也是上調的。最近， VEGFR3的配體VEGF-C和VEGF-D被確定為哺乳動物中淋巴管生成的調