艱難梭菌是產生對人類為致病性的兩種外毒素(腸毒素A和細胞毒素B)的孢子形成革蘭氏陽性桿菌。
艱難梭菌是發達國家老年住院患者中抗生素相關感染性腹瀉的主要原因(Simor等人,2002)。艱難梭菌相關疾病(CDAD)的癥狀范圍從腹瀉到嚴重結腸炎、中毒性巨結腸、敗血癥和死亡。近年來，疾病發病率、嚴重程度和復發率的增加主要是由于與流行性醫院爆發相關的高毒性菌株的出現以及對常用抗生素的抗性的增加(Rupnik等人，2009)。
能夠中和艱難梭菌腸毒素A和細菌毒素B(該病原體的兩種毒素)的預防性疫苗被報道為在工業發展下的候選疫苗實例(Donald R.等人，2013)。
毒素A和B分別是308kDa和270kDa的非常大的蛋白質，其在結構上相關，共享介導細胞毒性葡萄糖基轉移酶的細胞內攝取和遞送的同源功能結構域。
毒素A(腸毒素)由2,710個AA組成，并在其序列中顯示223個Lys殘基(8.22％陽離子性)；毒素B(細胞毒素)由2,366個AA組成，并在其序列中顯示156個Lys殘基(6.59％陽離子性)(參見參考網址：http://www.uniprot.org/uniprot/P16154和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AGG91548.1)。
盡管這兩種毒素在“體內”模型中的效力和效果各不相同，但過去在動物模型中的研究表明它們都促成天然感染中的疾病(Lyerly等人，1985)。此外，用毒素A和毒素B的疫苗接種(但不用單獨的任一個進行免疫接種)在感染的倉鼠模型中賦予保護(Libby J.M.等人，1982)。
體液免疫應答控制CDAD的能力的識別促進了將使用含有抗毒素A和B抗體的匯集的人免疫球蛋白的被動免疫治療成功用于治療嚴重的CDAD(Salcedo J.等人，1997)。此外，在使用A和B抗-毒素單克隆抗體結合標準抗生素治療的I期臨床試驗中實現了CDAD復發的減少(Lowy I.等人，2010)。
此外，在三名患有慢性復發性CDAD的小型研究中，使用福爾馬林滅活的A和B類毒素抗原的研究性疫苗防止CDAD復發(Sougioultzis S.等人，2005)。
總的來說，這些觀察結果提供了基于艱難梭菌毒素A和基于艱難梭菌毒素B的疫苗防止CDAD的驗證并鼓勵其進一步發展。如上所述，現在在臨床試驗中存在兩種候選疫苗，其基于兩種重組/福爾馬林處理的類毒素蛋白A和B。
用于開發基于針對艱難梭菌類毒素的單一特異性的疫苗的策略(通過福爾馬林處理或通過DNA重組技術解毒)被良好地記載，如上所述。還有被良好記載的是使用艱難梭菌重組腸毒素A(rARU)作為用于被制備為單一綴合物的弗氏志賀氏菌(S.flexneri)2a型、大腸桿菌K1和肺炎球菌14型的莢膜Ps的每一種的載體蛋白的研究(Pavliakova D.等人，2000)。顯然，由于注射的載體蛋白質(即艱難梭菌腸毒素A的重組重復單元)的總量(而非異質性)(對于各綴合物Pn14-rARU、SF-rARU和K1-rARU分別為1.29μg、3.9μg和8.08μg的rARU)，單一的三種綴合物的同時施用不可避免地導致宿主的免疫系統的過載這是。
最近，該兩種毒素的結構部分已被用作用于艱難梭菌的Ps II抗原的無毒載體(Romano M.等人，2014)。雖然艱難梭菌還產生三種不同的莢膜Ps，但證據指向兩種毒素作為有效戰斗病理學的靶，如在白喉和破傷風感染的歷史病例中的。
然而，這些以前的工作沒有報道關于制備用于在人類宿主(特別是兒童)中誘導針對來自抗生素抗性腸致病性細菌的幾種碳水化合物抗原的免疫(多特異性)(同時使用最小量的載體蛋白來減少疫苗對宿主免疫系統的抗原性負荷，同時保持通過施用單價綴合物可定性實現的特異性免疫原活性和體內保護)的廣譜腸疫苗的可能性。然而，與單價抗體相比，動物模型不允許在由本發明的多種抗原誘導的抗體滴度的定量方面得出結論，因為本領域的專家公知的是，只有人類嬰兒可以可靠地區分綴合物實體的不同模型的最終不同的輔助T-依賴性活性。
本發明的作者現已獲得了多表位分子構建體作為用于制備多表位糖綴合物疫苗的基本單元，所述多表位糖綴合物疫苗用作用于保護人群免受腸致病性細菌影響的廣譜腸疫苗。事實上，本發明的作者集中于目前對于已經變成抗生素抗性的幾種腸道病原體報道的緊迫問題：革蘭氏陽性厭氧細菌艱難梭菌和革蘭氏陰性細菌傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、弗氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、宋氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、豬霍亂沙門氏菌、克雷伯氏菌、腸桿菌、銅綠假單胞菌。由于它們的與日俱增的抗生素抗性，因這組細菌引起的腸道感染可能經常導致敗血癥，從而導致宿主死亡。
因此，本發明的目的是由包含共價結合至來自腸致病性細菌的不同血清學特異性的最少三個碳水化合物結構的輔助T-依賴性載體解毒的蛋白的基本單元組成的抗原性多價分子構建體，所述輔助T-依賴性載體解毒的蛋白選自來自艱難梭菌的腸類毒素A和細胞類毒素B，所述碳水化合物結構選自細菌多糖或解毒的脂多糖(例如SAEP-解毒的LPS或類內毒素)，其中每個碳水化合物結構包含至少一個由最少5至12個單糖殘基(優選最少8至12個單糖殘基)組成的重復基本表位，其中至少1摩爾的載體蛋白共價結合至少1摩爾的類型特異性或群特異性碳水化合物結構，或共價結合碳水化合物結構的總量，所述總量被認為是所述至少三種類型特異性或群特異性碳水化合物的總和。優選地，通過分子質量測定和NMR波譜評估所述糖殘基，所述重復基本表位通過與類型特異性或群特異性多克隆或單克隆抗體的反應性(通過測定它們在抑制它們的同源性多糖-抗體參考系統中的各自MIC50值)進行抗原性評估。
根據本發明的腸致病性細菌是已經變得抗生素抗性的腸病原體，例如：革蘭氏陽性厭氧細菌艱難梭菌和革蘭氏陰性細菌傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、弗氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、宋氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、豬霍亂沙門氏菌、克雷伯氏菌、腸桿菌、銅綠假單胞菌。
根據本發明的優選實施方案，通過化學方法，例如福爾馬林處理，如歷史上已知用于白喉和破傷風類毒素的，或通過DNA重組技術，將來自艱難梭菌的類毒素蛋白腸類毒素A和細胞類毒素B解毒。
在根據本發明的分子構建體中，兩種類毒素蛋白質中的每一種可以支持最少三種具有不同抗原性的多糖(例如衍生自細菌莢膜多糖的寡糖或多糖)或最少三種具有不同抗原性的解毒脂多糖(或LPS，內毒素)。
然而，用LPS以此方式獲得的分子構建體導致毒性，因為LPS的脂質A部分活性地存在于分子結構中，并且可以通過與CD14和TLR4樣受體的相互作用激活LPS典型的促炎細胞因子級聯。為了追求并實現類毒素-LPS綴合物實體的安全使用，LPS結構因此必須進行解毒。
這可以通過以下方式實現：
1)切割掉脂質A部分，或
2)通過使用合成的抗內毒素肽(SAEP)的特定策略來飽和脂質A結合位點，以獲得保留其完整的呈膠束樣結構形式的超分子抗原庫的類內毒素(或稱為SAEP-解毒的LPS，SAEP-解毒的內毒素)(WO 2004/052394 A1)。
后一種解毒方法是本發明上下文中的優選實施方案。具體地，源自給定物種特異性(免疫型)內毒素(脂多糖)的類內毒素根據Rustici等人(Science 259:361-365,1993)報道的科學概念以及在美國專利6,951,652和美國專利7,507,718中報道的先前公開的分子細節中制備。
因此，類內毒素是由SAEP、合成的抗內毒素肽和LPS(內毒素)的等摩爾復合物組成的分子實體，其在與艱難梭菌類毒素(A或B)的多表位綴合物的形式中滿足化學方程：
類毒素-(LPS)3+3SAEP→類毒素-(類內毒素)3
(也參見實施例3)。
根據本發明的分子構建體的優選實施方案，莢膜多糖抗原可以選自包含大腸桿菌K型(1,2,5,12,13)、傷寒沙門氏菌(Vi抗原)、霍亂弧菌0139和艱難梭菌的組。
作為革蘭氏陽性細菌的艱難梭菌的特征還在于涉及至少三種不同Ps結構(PsI，PsII和PsIII)的碳水化合物莢膜。
根據本發明的分子構建體的另一個實施方案，所述兩種類毒素蛋白質用作輔助T-依賴性載體，用于特異于弗氏志賀氏菌2a、霍亂弧菌01、豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌0157/101/111、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、宋氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌1型和豬霍亂沙門氏菌的解毒脂多糖(優選SAEP解毒的LPS或類內毒素)的糖綴合物。
根據本發明的分子構建體誘導針對兩種載體蛋白(艱難梭菌的腸類毒素A和細胞類毒素B)的血清學特異性，并且誘導針對與該兩種載體蛋白的每一個結合的至少三種攜帶的碳水化合物結構(簡稱為Ps或LPS/類內毒素)的每一種的血清學特異性，以使得相對特異性抗體顯示針對艱難梭菌的同源天然毒素(腸毒素A和細胞毒素B)的中和活性，以及針對傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌(其它優選的碳水化合物抗原來自弗氏志賀氏菌，鼠傷寒沙門氏菌，霍亂沙門氏菌，宋氏志賀氏菌和來自艱難梭菌本身)的殺菌活性。
根據上述，作為非限制性系列實例，作者已經制備了以下分子構建體：
-與傷寒沙門氏菌(Vi)、豬霍亂沙門氏菌(0139)和大腸桿菌(K1)的Ps共價結合的腸類毒素A；
-與傷寒沙門氏菌(Vi)、豬霍亂沙門氏菌(0139)和大腸桿菌(K1)的相同的三種Ps共價結合的細胞類毒素B；
-與腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌和痢疾沙門氏菌的LPS/類內毒素共價結合的腸類毒素A；
-與腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌和痢疾沙門氏菌的相同的三種LPS/類內毒素共價結合的細胞類毒素B。
本發明還涉及用于疫苗中的上述抗原性多價分子構建體，其用于保護受試者免受由于選自艱難梭菌、傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、腸炎沙門氏菌、弗氏志賀氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、痢疾沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌或其組合的至少一種腸致病性細菌的感染。
在優選的實施方案中，單一的抗原性多價分子構建體或不同抗原性多價分子構建體的組合可以用于疫苗的制備。
本發明的另一個目的是疫苗制劑，其包含在生理學上可接受的載體中的至少一種如上所述的抗原性多價分子構建體，任選地與藥學上可接受的佐劑或賦形劑一起。
抗原性分子構建體可以具有載體抗原和攜帶的抗原的均質或混合模式。術語載體抗原指來自艱難梭菌的類毒素蛋白腸類毒素A或細胞類毒素B；術語攜帶的抗原指結合至該兩種載體蛋白質中的每一種的碳水化合物結構(簡稱為莢膜Ps或LPS/類內毒素)。術語均質或混合是指攜帶的抗原相對于載體抗原的來源(即所有載體和攜帶的抗原來源于艱難梭菌；攜帶的抗原來源于相同或不同的腸病原體)。
根據本發明疫苗制劑的優選實施方案，每種載體抗原和/或攜帶的抗原的劑量范圍為0.1至100μg，優選為1-10μg。
優選地，所述疫苗制劑還包含礦物或化學合成或生物學佐劑。礦物或化學合成或生物佐劑可與本申請中公開的分子構建體一起使用，以受益于可有效降低人中的最佳免疫原性劑量的任何免疫增強，從而進一步減少載體蛋白的總量。特別地，在用于人類的根據本發明的疫苗制劑中的優選無機佐劑選自磷酸鋁(AlPO4)和氫氧化鋁；優選的有機佐劑選自基于角鯊烯的佐劑，例如MF59，QF 21，Addavax；優選的生物抗原選自細菌抗原單磷酰脂質A，海藻糖二糖霉菌酸(trehalose dicorynomycolate)(Ribi's佐劑)。
在用于獸醫學領域的疫苗制劑中，弗氏佐劑(完全或不完全)是優選的。佐劑的劑量可以是0.1-1mg/劑量，優選為0.5mg/劑量。
更優選地，這樣的制劑適合于通過皮下或肌內或皮內或經皮途徑施用。方便地，這樣的施用可以通過常規的注射器注射或無針工具進行。
根據本發明的疫苗制劑可以根據需要單次或多次施用的方案施用，按照醫生、兒科醫生或獸醫指導。
本發明還涉及如上所定義的廣譜多價疫苗制劑，其用于醫學人類或獸醫領域，用于保護受試者免受由于選自下述的至少一種腸致病性細菌引起的感染：艱難梭菌、傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、腸炎沙門氏菌、弗氏志賀氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、痢疾沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌或其組合。優選地，所述待治療的受試者屬于兒科和老年群體。
這樣的疫苗(例如：Ps和LPS所來源于的革蘭氏陰性腸細菌的物種特異性)的實際配制可以取決于區域流行病學，以使得每個三聯抗原綴合物(盡管總是使用來自艱難梭菌的兩個載體蛋白腸類毒素A和細胞類毒素B中的一個或兩個)根據選定的區域流行病學將有意攜帶特異性Ps或LPS/類內毒素抗原。
在本發明的一個具體實施方案中，疫苗制劑包含至少兩種不同的抗原性分子構建體，其中來自艱難梭菌的兩種蛋白腸類毒素A和細胞類毒素B各自可用作艱難梭菌的三種多糖(PsI，PsII和PsIII)的載體蛋白，使得兩種組合的三個一組的綴合抗原將代表限于艱難梭菌的感染的特異性疫苗，其中由該兩種蛋白質類毒素誘導的抗毒性活性可以與局部和全身性抗莢膜活性平行，從而導致由宿主免疫系統清除細菌。
這樣的單一-三個一組的分子構建體還被配制為含有兩種類型的抗原分子模型的組合多價組合物，用于實現最寬的抗原譜，例如：
-與傷寒沙門氏菌(Vi)、豬霍亂沙門氏菌(0139)和大腸桿菌(K1)的Ps共價結合的腸類毒素A，其與共價結合于相同的三種Ps抗原的細胞類毒素B組合；
-與傷寒沙門氏菌(Vi)、豬霍亂沙門氏菌(0139)和大腸桿菌(K1)的Ps共價結合的腸類毒素A或細胞類毒素B，其與共價結合于腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌和痢疾沙門氏菌的三種類內毒素抗原的細胞類毒素B或腸類毒素A組合。
最近有關實驗證據通過將腸細菌作為諾如病毒感染的刺激因子表明，人和小鼠諾如病毒在體外并且可能在體內感染B細胞。已經提出這種生物協同作用是基于諾如病毒可以變得感染性并在人中發展流行性和散發性胃腸炎的機制(Jones M.K.等人,Science,346:755-759,2014)。
與這些觀察一致，經歷抗生素治療以消耗腸道微生物群的鼠宿主由作者報道的實驗中顯示小鼠諾如病毒復制的顯著減少。
根據這個證據，本申請的作者得出了使用本文公開的疫苗組合物靶向抗生素抗性腸致病性細菌的不斷擴展的世界以可能地限制負責急性胃腸炎的諾如病毒復制和并行地腸道細菌感染的原理。
諾如病毒性胃腸炎是一種普遍的和潛在嚴重的疾病，其特征在于惡心、嘔吐、腹部痙攣、腹瀉和偶爾發燒的急性發作。諾如病毒是高度感染性的，并且容易從人到人或通過污染的環境傳播。流行病爆發發生在社區環境中，特別是醫院、酒店、學校、日托設施和療養院，對家庭、醫療保健系統和企業造成的社會經濟成本不斷上升。當病毒襲擊時，軍事單位受到顯著影響，因為爆發影響戰斗準備。在老年人、兒童和免疫受損個體(在其中感染可導致嚴重的并發癥并且甚至可導致死亡)中報道了嚴重的臨床結果。據估計，在全世界，諾如病毒導致五個病毒性胃腸炎病例中的一個。估計每年有3億諾如病毒感染的病例導致大約26萬人死亡，大多在低收入國家。諾如病毒被分類為至少5個基因組和至少40個基因型；最近在兒童和老年人中評估了它們在選定地理區域的分布情況，年輕兒童(≤5歲)的發病率為1,475例/100,000人/年，老年人(≥65歲)的發病率為585例/100,000人/年(Chan M.等人,Scientific Reports,2015)。隨著時間的推移，諾如病毒通過抗原漂移逃避天然免疫，這允許它們逃避響應早期感染產生的抗體。
因此，本發明的另一方面是提供用于預防和/或治療腸致病性細菌的廣譜多價疫苗制劑，其隨后可以并行地靶向由人類諾如病毒引起的病毒性胃腸道感染。
最近開發諾如病毒疫苗的努力集中在由病毒衣殼(外殼)的分子構建的病毒樣顆粒(VLP)上。在I期臨床試驗中，一種多價VLP疫苗引起抗體產生，但沒有賦予針對所測試的病毒株的免疫力。然而，在最近的一項研究中，Lindesmith及其同事(2015年)就針對疫苗VLP和代表不包含在疫苗中的病毒的VLP的抗體表征了來自十個多價VLP疫苗臨床試驗參與者的血清標本。研究人員發現，VLP疫苗可以迅速引發針對廣泛范圍的疫苗和非疫苗VLP(包括它們以前不能遇到的代表人類諾如病毒的兩個VLP)的抗體應答。總體而言，針對參與者先前暴露于的諾如病毒株的抗體主導免疫應答。這些發現可以鼓勵基于諾如病毒的疫苗的開發，假設這種方法可以克服諾如病毒通過抗原漂移逃避免疫的能力。在任何情況下，這將是導向于最終包含在感染階段期間的病毒的策略(而不是一旦它仍然在屏蔽它的腸致病性細菌中阻斷在基部的病毒復制)，其中病毒顆粒擴散出容納它的細菌細胞，如本申請的作者通過使用靶向腸致病性細菌的廣譜疫苗所提出的。最終，這兩種策略(例如，使用靶向諾如病毒及其細菌宿主的兩種疫苗)的伴隨和/或平行使用可以構成用于實現人宿主的廣譜抗病毒保護的有力工具。
本發明還涉及用于制備根據本發明的抗原性多價分子構建體的綴合方法(其采用在專利EP 1501542中公開的相同化學方法)，其中所述至少三種碳水化合物結構中的每一個通過經由氧化的O-脫氫解偶聯和形成與烷基二胺間隔基的亞胺還原鍵的還原胺化化學活化至單官能性或多官能性，然后衍生化為活性酯，這樣的酯衍生的碳水化合物結構最終并同時通過形成酰胺鍵偶聯至來自艱難梭菌的多官能性載體蛋白細胞類毒素B或腸類毒素A的氨基，所述碳水化合物結構選自：
-傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、艱難梭菌和大腸桿菌的莢膜多糖，或
-來自艱難梭菌、傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、腸炎沙門氏菌、弗氏志賀氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、痢疾沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌的脂多糖；
其中至少一摩爾的載體蛋白與至少一摩爾的碳水化合物結構反應，考慮這樣的總量是由至少三個類型特異性或群特異性碳水化合物結構中的每一個的摩爾總和組成的量。優選地，所述碳水化合物結構在其相應的二胺丁酸衍生物中被化學活化，并且活性酯是琥珀酰亞胺酯。
作為實例，根據申請人公開的方法，將三個一組的來自傷寒沙門氏菌、大腸桿菌和霍亂弧菌的莢膜的多糖化學活化至它們的同源Ps-DAB(二胺丁酸衍生物)根據EP 1501542的權利要求1中由申請人公開的方法進行，而多官能性載體蛋白質是來自艱難梭菌的腸類毒素A和細胞類毒素B。
或者，用于制備本發明的抗原性多價分子構建體的綴合方法使用EP 1501542的權利要求8中公開的化學法，涉及來自艱難梭菌的多官能性載體蛋白細胞類毒素B或腸類毒素A的氨基與至少三個不同碳水化合物結構的經由形成亞胺還原鍵的還原胺化的同時偶聯(或逐步偶聯)，所述碳水化合物結構選自：
-傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、艱難梭菌和大腸桿菌的莢膜多糖
-來自傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、腸炎沙門氏菌、弗氏志賀氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、痢疾沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌的脂多糖
這樣的碳水化合物結構在具有或不具有間隔基的情況下通過經由氧化的O-脫氫解偶聯被在先活化至單官能性或多官能性；
其中至少一摩爾的載體蛋白與至少一摩爾的碳水化合物結構反應，考慮這樣的總量是由至少三個類型特異性或群特異性碳水化合物結構中的每一個的摩爾總和組成的量。
根據本發明，提及載體蛋白和特定碳水化合物抗原的術語摩爾包括一般測量單位(摩爾)或其分數(即微摩爾或納摩爾或皮摩爾，全部代表其分數)。
當根據本發明的綴合方法涵蓋脂多糖時，它們應是解毒的。因此，綴合方法進一步包括將所述脂多糖解毒的附加步驟，所述解毒可選擇地通過以下進行：a)在進行偶聯反應之前或之后切割掉脂質A部分、或b)在進行偶聯反應之前或之后通過使用合成的抗內毒素肽(SAEP，如SAEP2，參見Rustici等人，Science 259：361-365,1993)的特定策略來飽和脂質A結合位點。
優選地，這樣的解毒脂多糖通過美國專利6,951,652(參見第16頁和權利要求1)和美國專利7,507,718(參見第33-34頁和權利要求17)中的相同作者公開的上述后一程序獲得，以獲得保留超分子膠束樣LPS結構的最佳抗原性特征的相應類內毒素，用于相對免疫原性質的最佳表達。
除了上述解毒方法之外，可以使用其它方法用于該目的，并且尤其可以考慮通過遺傳工程化通過修飾導致脂質A合成的酶促途徑的LPS解毒以及通過存在于脂質A結構中的酯連接的脂肪酸鏈的酶促或化學水解的解毒。
此外，在本發明的綴合方法的優選實施方案中，步驟a)的碳水化合物結構包含至少一個由如通過分子質量測定和NMR波譜法測定的最少5至12個單糖殘基組成的重復基本表位，所述重復基本表位通過與類型特異性或群特異性多克隆或單克隆抗體的反應性通過測定它們在抑制其同源多糖-抗體參照系統中的各自MIC 50值而抗原性地評估。
代表本發明的最終目的的是可通過上述的綴合方法獲得的抗原性多價分子構建體。
如可以推斷的，上述公開的分子模型可以被進一步開發以每單個摩爾(或其分數)的蛋白質載體含有多于三個(例如四個或五個)不同的碳水化合物結構，這種可能性取決于分子構建體的三個主要參數：
a)載體蛋白的物理-化學特征，其結構應當具有最高可能量的賴氨酸殘基(反應性-NH2基團的來源)；
b)不同碳水化合物結構的“特別”選擇的多分散MW，具有最佳活化率同時限制偶聯反應中空間位阻現象的負面影響，以及
c)用于活化不同碳水化合物結構和用于合成分子構建體的化學法的效率(用于碳水化合物結構的最佳活化中的高效率的優選化學法是在具有或不具有間隔基的情況下經由氧化的O-脫氫解偶聯，而用于綴合反應中的高效率的優選化學法是通過碳水化合物結構和載體蛋白之間的經由活性酯的酰胺鍵形成；對于綴合反應還優選的是使用具有或不具有間隔基的O-脫氫解偶聯氧化的碳水化合物結構與載體蛋白之間經由直接還原胺化的亞胺還原鍵的形成的化學法。
根據本發明使用的綴合方法預見了(至少三個)Ps或LPS(其因而可以具有無差別地(盡管均質地)低或高的MW)的多步活化，以便優化與載體蛋白的偶聯產率。
本分子構建體的化學計量特征(蛋白質/Ps或蛋白質/LPS的w/w比率)(其進而與分子構建體的免疫劑量相關)通過國際專利申請PCT/EP2014/051670中公開的免疫化學方法進行。
這允許在本發明中確定Ps或LPS的定量的量的可能性，即使當具有非常相似的結構時，如果存在于相同的分子構建體中。
最后，本發明涉及將疫苗制劑中的載體蛋白質的量限制到如與更廣泛抗原庫的綴合物抗原相關的免疫原性可能的最小量，以控制可通過上文公開的綴合方法獲得的分子構建體對宿主免疫系統的抗原性負荷。此策略與目前已知為“載體特異性免疫干擾”的臨床現象的遏制一致，所述載體特異性免疫干擾涉及在給定的糖綴合物疫苗組合物中使用的載體蛋白的量，當考慮在哺乳動物宿主的免疫途徑期間施用的其它疫苗的情況時(Dagan R.等人,2010；Lee L.H.and Blake M.S.,2012)。
在下面的實驗部分中，將根據優選實施方案更詳細地公開本發明。這樣的實施方案應當被認為不限制本專利公開內容的保護范圍，而僅僅是為了舉例說明的目的。
實施例
實施例1：
i)具有載體蛋白腸類毒素A的包含傷寒沙門氏菌(Vi)、大腸桿菌(K1)和豬霍亂沙門氏菌(0139)的多糖的四價綴合物抗原的合成；
ii)具有載體蛋白細胞類毒素B的包含傷寒沙門氏菌(Vi)、大腸桿菌(K1)和豬霍亂沙門氏菌(0139)的多糖的四價綴合物抗原的合成。
三個Ps至同源Ps-DAB(二胺丁酸衍生物)的化學活化
此步驟根據上述專利EP1501542的權利要求1(步驟A1)中申請人公開的方法進行。使用國際申請號PCT/EP2014/051670中報道的1H-NMR波譜進行這樣的活化的特定控制以及獲得的活化Ps結構的特性。
Ps-DAB衍生物的1H-NMR分析
1.用于NMR分析的Ps和Ps-DAB衍生物的溶液
將3-4mg多糖樣品(PS)或PS-DAB溶解在0.7ml D2O-磷酸鹽緩沖液中并轉移到5mm NMR管中。在D2O中制備的磷酸鹽緩沖液的濃度為100mM，pH＝7。使用三甲基硅丙酸鈉鹽(TSPA)(CH3)3Si(CD2)2COONa用作內參。TSPA的濃度為1mM。
2.NMR設備
使用高場NMR波譜儀(600MHz)。使用具有能夠以至少55G·cm-1的強度在z方向(平行于磁場)上產生梯度的z梯度線圈的高分辨率5mm探頭。
3.NMR實驗設置
在將樣品引入磁體內之后，進行所有常規程序：調諧和匹配，勻場，90度脈沖校準。預飽和可用于壓制殘余HDO信號。為了良好的預飽和，光譜中心(O1)必須精確地設置在HDO信號上(約4.80ppm)，并且良好的勻場也是期望的。
在調節用于預飽和的參數之后，檢查擴散梯度實驗的參數。使用具有縱向渦流延遲的雙極性梯度的受激回波脈沖序列。
4.DAB活化的指紋圖譜
基團–CH2-NH2在3.08ppm
基團–CH2-NH-CH2-在3.17ppm
5.Ps上DAB活化的百分比
DAB活化的百分比在0.5-5.0％摩爾DAB/摩爾BRU(群特異性Ps的基本重復單元)的范圍值中，最佳摩爾范圍為1.5-3.0％。
Ps Vi、Ps 0139、Ps K1至其同源活性酯的衍生化作為Ps-DAB-MSE衍生物
此步驟根據歐洲專利EP 1501542的權利要求8中申請人公開的方法進行，在此將該專利作為參考資料。
將三個活化的(多官能性)Ps與(多官能性)載體蛋白腸類毒素A或細胞類毒素B的同時偶聯
根據在歐洲專利EP1501542的權利要求8中申請人公開的方法進行綴合物的化學合成，也稱為偶聯反應。然而，此程序在本文可以被認為是創新性的，因為三個偶聯反應是同時進行的，而不是在該專利中的在一個偶聯反應中進行的(或逐步的方法)。
這個程序可能優于每個Ps活化的抗原的逐步偶聯，原因簡單地在于縮短反應時間，因此改善了反應的效率，條件是三個活化的Ps處于在平衡時相當地競爭偶聯反應的條件下(此特征包括相當的平均MW，相當的Ps-DAB活化的范圍和蛋白質的反應基團與活化的Ps的反應基團之間的相當的化學計量比)。
反應的適當化學計量保持考慮琥珀酰亞胺酯相對于活化的三個Ps抗原和可用的載體蛋白的氨基的總量。優選設定化學計量以考慮不超過20-25％的在腸類毒素A或細胞類毒素B(作為實例)的結構中可用的氨基的反應性，以使蛋白質最佳地保存其抗原庫。
腸類毒素A或細胞類毒素B(簡稱為類毒素)與Ps-DAB衍生物(Ps-DAB)的偶聯反應與以下化學計量一致：
類毒素+4Ps-DAB(MSE)→類毒素-(Ps)3+Ps-DAB(MSE)
其中實體Ps-DAB(MSE)衍生物是指反應中三個類型特異性Ps結構的每一個的相等份的總和，從而產生對于攜帶的總共3摩爾類型特異性Ps的平均1摩爾蛋白質的綴合物，加上應有的過量的Ps-DAB(MSE)衍生物，如由平衡常數所規定的：
此方程是指由等份的DAB-活化的Ps抗原的總和得到的總活性酯(MSE)的濃度，其進而與存在于每個活化的Ps抗原中的通過1H-NMR波譜法定量的DAB接頭的量是可比較的(在摩爾基礎上Ps-DAB至Ps-DAB(MSE)的轉化率≥98％)。
該化學方程為類毒素載體蛋白的完全糖基化提供了證據。此方程還顯示綴合反應取決于兩種試劑、親核體(通過其Lys殘基的ε-NH2基團的類毒素)和親電體(Ps衍生物的酯基團的羰基部分)的濃度，因此被定義為SN2反應。
上述考慮與實驗觀察結果一致，即用類毒素作為載體蛋白獲得的糖基化反應中的最高產率是反應中存在的100％的載體蛋白和約80％(w/w)的Ps-DAB-衍生物，它們的剩余部分是向右側推動平衡所需的少量未偶聯的Ps衍生物。
在這種類型的反應中，溶劑影響反應速率，因為溶劑可以或可以不包圍親核試劑，因此阻礙或不阻礙其接近碳原子。極性非質子溶劑通常是用于此反應的比極性質子溶劑更好的溶劑，因為極性質子溶劑將通過溶劑的與親核體的氫鍵合而溶劑化，從而阻止其以離去基團碰撞碳。具有低介電常數或受阻偶極末端的極性非質子溶劑將有利于SN2方式的親核取代反應(優選的實例是：DMSO，DMF，四氫呋喃等)。
當考慮到反應是自發的(因此是放熱的)時，影響Keq的反應溫度是與所選擇的溶劑的使用相容的最低溫度，因此通常設定在4℃至20℃的溫度。
除了上文詳述的綴合化學法之外，可以使用其它化學法來實現多價綴合物抗原的合成；在這些之中，蛋白質(通過還原胺化)與氧化的Ps(通過O-脫氫解偶聯)的直接偶聯或使用可用于活化Ps和蛋白質的異源和化學互補的接頭。
此外，除了使用導致通過蛋白質的多官能性和Ps組分的多官能性獲得多價交聯蛋白-PS綴合物的化學法的策略以外，可以考慮如基于在其末端還原基團處被活化用于隨后偶聯至載體蛋白的來源于莢膜Ps或LPS的脂質A剝除的寡糖的寡糖的本文公開的抗原性多價分子構建體的合成，如申請人在上述論文Porro M.等人in Molecular Immunology,23:385-391,1986中的另一個綴合物抗原模型中所示的。
最后，可以認為所公開的分子構建體通過使用“特別”的DNA重組技術在細菌或酵母細胞或其它工程改造的活細胞中的酶促糖基化來制備。
實施例2：
iii)具有載體蛋白細胞類毒素B的包含腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌和痢疾沙門氏菌的LPS(脂多糖)的四價綴合物抗原的合成；
iv)具有載體蛋白腸類毒素A的包含腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌和痢疾沙門氏菌的LPS(脂多糖)的四價綴合物抗原的合成。
三個LPS至同源LPS-DAB衍生物(二胺丁酸衍生物)的化學活化
將三個LPS在它們的O-抗原碳水化合物部分中化學衍生至相應的-DAB衍生物(參見下面的圖，其顯示在作為LPS分子的最親水部分的O-抗原碳水化合物部分內的DAB活化區域)。“核心”結構難以被活化，因為它非常接近疏水區(脂質A)，其是負責LPS的膠束樣結構的相當kriptic型的結構(kriptic structure)，還也負責LPS的生物毒性(例如局部和全身炎癥，TNF-和IL6-介導的，隨后為致熱原性)以及抗原性和免疫原性的最佳表達。在本申請的優選實施方案中，然后通過與SAEP的高親和力結合選擇性阻斷LPS的生物毒性，這保留了LPS的與其超分子膠束樣結構相關的這樣的最佳特征。
DAB活化的步驟根據在上述專利EP1501542的權利要求1(步驟A1)中申請人公開的方法進行。使用國際申請號PCT/EP2014/051670中報道的1H-NMR波譜進行這樣的活化的特定控制以及獲得的活化Ps結構的特性。
關于-DAB衍生物的1H-NMR分析如以上對于實施例1所報告的進行。
下圖代表腸桿菌科的一般LPS結構，其具有DAB活化的定位位點(與載體蛋白綴合所必需的)和必要的生物解毒，優選通過SAEP(合成的抗內毒素肽)進行，其允許實現解毒，同時LPS保留其超分子膠束樣抗原結構)。
腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌和痢疾沙門氏菌的LPS至其同源活性酯的衍生化作為LPS-DAB-MSE衍生物
此步驟根據歐洲專利EP 1501542的權利要求8中申請人公開的方法進行。
將三個活化的(多官能性)LPS與(多官能性)載體蛋白腸類毒素A的同時偶聯
上面在實施例1中報告的化學方程式也適用于類毒素和LPS衍生物的綴合物：
類毒素+4LPS-DAB(MSE)→類毒素-(LPS)3+LPS-DAB(MSE)
以使得：
此方程是指由等份的DAB-活化的LPS抗原的總和得到的總活性酯(MSE)的濃度，其進而與存在于每個活化的LPS抗原中的通過1H-NMR波譜法定量的DAB接頭的量是可比較的(在摩爾基礎上LPS-DAB至LPS-DAB(MSE)的轉化率≥98％)。
根據在歐洲專利EP1501542的權利要求8中申請人公開的方法進行綴合物的化學合成，也稱為偶聯反應。然而，此程序在本文可以被認為是創新性的，因為三個偶聯反應是同時進行的，而不是在該專利中的在一個偶聯反應中進行的(或逐步的方法)。這個程序可能優于每個Ps活化的抗原的逐步偶聯，原因簡單地在于縮短反應時間，因此改善了反應的效率，條件是三個活化的Ps處于在平衡時相當地競爭偶聯反應的條件下(此特征包括相當的平均MW，相當的LPS-DAB活化的范圍和蛋白質的反應基團與活化的LPS的反應基團之間的相當的化學計量比)。然而，以這種方式獲得的分子構建體導致毒性，因為LPS的脂質A部分活性地存在于分子結構中。為了追求并實現類毒素-LPS綴合物實體的安全使用，LPS結構因此必須經歷可選擇地通過切割掉脂質A部分或通過使用合成的抗內毒素肽(SAEP)的特定策略的脂質A結合位點的飽和來進行的解毒。后一種解毒方法是本發明上下文中的優選實施方案(參見下一個實施例3)。
實施例3：從它們的同源腸類毒素A-LPS(內毒素)/細胞類毒素B-LPS(內毒素)綴合物制備腸類毒素A-類內毒素綴合物和細胞類毒素B-類內毒素綴合物
類內毒素是能夠誘導針對其同源LPS的特異性免疫活性的無毒性抗原，所述同源LPS是暴露于革蘭氏(-)細菌表面上的天然主要毒性抗原。
一本全面的、可公開獲得的教科書(其詳細列出了來自革蘭氏陰性細菌的內毒素抗原的許多科學方面)是由Kevin L.Williams編輯的“Endotoxins”,Informa Health Care USA Inc.,publisher,New York(2007)。
類內毒素是由SAEP(合成的抗內毒素肽)與LPS(內毒素)的脂質A部分的等摩爾復合物組成的分子實體：
類毒素-(LPS)3+3SAEP→類毒素-(類內毒素)3
源自給定物種特異性(免疫型)的內毒素(脂多糖)的類內毒素根據Rustici等人(Science 259:361-365,1993)報道的科學概念在美國專利6,951,652和美國專利7,507,718中報道的先前公開的分子細節中制備。
類內毒素的免疫學活性涉及具有經由免疫學中被稱為調理吞噬(OP或巨噬細胞和PMC中的抗體介導的細菌吞噬)的機制和直接的殺細菌(DB，抗體介導的細菌細胞壁的裂解)(兩種機制均由補體途徑的活化介導)的生物活性(殺菌效應)的IgG(主要)和IgM同種型的多克隆抗體。
類內毒素是動物模型中的輔助T-依賴性抗原，但尚未在人類嬰兒(其中免疫系統直到2歲以上才完全發育)中經歷。由于這個原因，在本申請中考慮了與輔助T-依賴性載體蛋白(如上述報告的艱難梭菌的兩種類毒素蛋白)的綴合，用于制備所需的疫苗產品。
因此，腸類毒素A或細胞類毒素B與選定的物種特異性LPS(內毒素)的綴合物已在美國專利號5,010,627(參見第33-34頁和權利要求17)中一般性報道的條件下與SAEP2(Rustici等人,Science 259:361-365,1993)反應，以便實現類毒素綴合的LPS的解毒，從而形成相對同源的類毒素綴合的類內毒素。
制備了以下類毒素綴合的類內毒素：
-共價綴合至甲型副傷寒沙門氏菌、痢疾沙門氏菌、腸炎沙門氏菌的類內毒素的腸類毒素A；
-共價綴合至甲型副傷寒沙門氏菌、痢疾沙門氏菌、腸炎沙門氏菌的類內毒素的細胞類毒素B；
共價綴合至甲型副傷寒沙門氏菌、痢疾沙門氏菌、腸炎沙門氏菌的類內毒素的CRM197作為良好建立的輔助T-依賴性載體蛋白可用于控制動物模型中的免疫實驗。
實施例4：包含綴合至載體蛋白腸類毒素A的傷寒沙門氏菌(Vi)，大腸桿菌(K1)和豬霍亂沙門氏菌(0139)的多糖的四價綴合物抗原與包含綴合至載體蛋白細胞類毒素B的腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌和痢疾沙門氏菌的LPS/類內毒素的四價綴合物抗原的組合。
通過以適合用于在實施例8中報告的動物模型中的免疫原性研究的劑量聯合兩種類型的分子模型來制備該組合。
實施例5：包含與載體蛋白腸類毒素A或細胞類毒素B綴合的傷寒沙門氏菌(Vi)，大腸桿菌(K1)和豬霍亂沙門氏菌(0139)的多糖的抗原性多價分子構建體的物理化學分析
已經使用Sepharose 4B-CL上的GPC分析(凝膠滲透色譜法)進行實施例1的抗原性多價分子構建體的物理分析。高分子量(HMW)多價抗原的純化簡單地通過從Kd＝0.00至Kd＝0.30收集和合并洗脫級分來獲得。
分子構建體的基本單元的聚合物作為交聯分子實體獲得，利用Ps抗原的多官能性(基于摩爾約2％的DAB活化，如通過1H-NMR波譜證實的)和多官能性的載體蛋白(通過TNBS反應測定，包含序列的整個2,710個AA的結構內的約104個反應性氨基/摩爾類毒素A，從毒素A的天然223個Lys殘基中保留的+1氨基末端AA；通過TNBS反應測定，在包含序列的整個2,366AA的結構內的約85個反應性氨基/摩爾類毒素B，從毒素B的天然156個Lys殘基保留的+1氨基末端AA)。
鑒于上述，所分析的綴合物表現為多分散的、單體至聚合的分子實體，其包含化學方程式中報告的分子構建體的基本單元，其中HMW衍生自包含腸內毒素A(MW＝3.08x105)或細胞類毒素B(MW＝2.70x105)和三個Ps/LPS抗原中的每一個的平均MW＝105(或總共約3.0x105)的基本聚合單元，導致每基本單元綜合平均MW為6.10x105；因此，這種基本結構的幾個交聯單元達到幾百萬并主要在Sepharose 4B-CL柱的Vo下洗脫。
載體蛋白與三個類型特異性Ps中的每一個之間的w/w比為約3.6(下表1)；此w/w比產生大約1.0的平均摩爾比(R)蛋白/類型特異性Ps，對應于1摩爾蛋白質/摩爾類型特異性Ps的平均比率，也通過化學方程式顯示。因此，實驗獲得的交聯的分子實體相應于由基本單元的幾個聚合單元構成的分子模型，該基本單元僅由攜帶總共三摩爾類型特異性Ps(每個類型特異性Ps一摩爾)的一摩爾載體蛋白組成。
實施例6：抗原性多價分子構建體腸類毒素A-PsVi、PsK1、Ps0139或細胞類毒素B-PsVi、PsK1、Ps0139的免疫化學分析
通過抑制性ELISA分析GPC純化的分子構建體，以確定四種血清不同的多克隆抗體(PAb)的血清學特異性，和確定構建體的每種抗原的定性和定量存在，如國際專利申請PCT/EP2014/051670中公開的。
通過使用抑制性ELISA，通過實驗確定的參數MIC50(作為同源參照Ps-Ab反應抑制劑的選擇的碳水化合物抗原的最小抑制濃度)，進行用于測試其定量當量的碳水化合物抗原的化學滴定和免疫化學滴定之間的比較，以便評價和關聯免疫化學方法相對于化學方法在這種分子構建體的分析控制中的精確性和準確性。
實施例7：測定活化或多價綴合形式的碳水化合物抗原的濃度：化學滴定與免疫化學滴定的比較
根據上文相對于抑制性ELISA報道的方法獲得的免疫化學滴度與根據在國際專利申請PCT/EP2014/051670的特定部分中報道的方法獲得的化學滴度相比；通過在使用已知的化學滴定的碳水化合物抗原量通過抑制性ELISA建立的參考標準曲線的線性部分上插值來確定活化或綴合形式的三個碳水化合物特異性抗原中的每一個的未知樣品的免疫化學滴度。
然后將用于上述每種分子構建體的定性和定量免疫化學分析的相同方法用于表征含有兩個分子構建體的聯合的多價疫苗的最終制劑，每個分子構建體由用作載體蛋白的艱難梭菌的兩種類毒素的三個一組Ps/LPS(類內毒素)綴合物構建，以獲得示例性的4價或8價疫苗的完整表征。
實施例8：與多價分子構建體的化學計量相關的疫苗制劑
這種用于腸道疫苗的廣譜制劑可以通過使用本發明的分子構建體安全地制備，其允許減少用于攜帶這樣數量的綴合的Ps和LPS(類內毒素)抗原的蛋白質載體的使用。具體參考含有包括最普遍的、流行病學顯著的特異性Ps和LPS/(類內毒素)的8價制劑的腸道疫苗的示例性制劑，根據上面在詳細描述基于攜帶Ps/LPS(類內毒素)的腸內毒素A和細胞類毒素B的分子構建體以及兩者的組合的各種實施例中報道的方法，合成了下列分子構建體(表1)，并作為優選實施方案的擴展示例進行分析。
根據本申請中報道的程序制備和配制的并且由所得分子構建體的化學計量所定義這種8價腸道疫苗中所示的兩種載體蛋白質類毒素(每種表達內置的多個表位)的總量符合相對于每個分子構建體的劑量的以下摩爾組成，所述分子構建體含有兩種載體蛋白類毒素(分別為MW＝308K和270K)的每一種的約1μg和三個選擇的DAB活化的類型特異性的Ps/LPS(類內毒素)抗原(基于兩種不同的分析標準平均MW＝100K，即通過在校準的濾膜上的分子過濾估計平均尺寸以及通過GPC估計平均尺寸，在所有情況下使用參考碳水化合物分子如各種MW的葡聚糖)。
表1
在示例的分子構建體中，蛋白質與Ps/LPS的(w/w)比的平均值為：3.61±0.39(10.8％)，對應于(摩爾/摩爾)比的平均值1.26±0.14(11.1％)。
計算和比較基于摩爾的綴合物抗原的特征的概念是基本的，因為免疫系統在摩爾基礎上加工抗原，如自然界在轉化物質的每個化學或生物化學反應中所做的，因此是指抗原的MW。
因此，根據每種類型特異性Ps/LPS抗原的平均MW和蛋白質載體類毒素的平均MW，綴合物抗原的摩爾比通過選擇其抗原成分而改變。對于輔助T-依賴性的可能最佳表達，最優選的是載體蛋白和每種類型特異性Ps抗原之間的摩爾比等于或高于1.0。除了此摩爾參數之外，考慮插入在蛋白質和每種類型特異性碳水化合物抗原之間的共價鍵的平均量也是重要的，其平行于類型特異性多糖的活化速率，因為此雜合分子區域被實驗提出負責綴合分子的獲得性輔助T-依賴性質(Arndt和Porro，1991)。
然而，如國際專利申請PCT/EP2014/051670中所詳述的，通過解決參與上述化學方程式中報道的化學平衡的試劑的量，可以根據不同的化學計量的合成來合成分子構建體，這可以導致不同化學計量的分子構建體，其中分子構建體中輔助T-依賴性載體蛋白的量可以根據這種分子構建體在人群的不同年齡組中的免疫原性的最佳表達來最佳選擇。在上述示例的兩種包含一至兩個分子構建體(各自攜帶三個類型特異性Ps/LPS)的4價至8價制劑中，分別地，每種載體蛋白質類毒素的總量為約1μg，而綴合的類型特異性Ps/LPS(類內毒素)的量為約0.3μg。
因此，上述報道的實施方案的目的是提供以下事實的證據：所公開的具有內置表位的多價抗原性分子構建體可以在寬范圍的化學計量參數中合成，以便隨后在哺乳動物宿主中(特別是在人類中)適當地限定構建體的最佳劑量，甚至當考慮通過這樣的廣譜疫苗制劑免疫的不同年齡組(從嬰兒到老年人)時也如此。
下表2顯示了通過使用相同的合成化學反應對于上述概念獲得的不同分子模型，盡管對于參與平衡的試劑使用不同的“特別”選擇的化學計量。
在下文中，報道了用于本申請中的兩種類毒素腸類毒素A和細胞類毒素B的一些考慮，因為它們是(或可以是)同源毒素的化學處理的衍生物。這種歷史性的程序(用于歷史性疫苗，如破傷風類毒素和白喉類毒素)是將毒素有意解毒用于作為免疫原的安全人類使用所必要的。在本申請中，我們已經認為純化的類毒素的平均MW與其所衍生的毒素的平均MW相當。然而，在其它特征中，類毒素和毒素之間的顯著差異存在于在化學解毒后保留在類毒素結構中的賴氨酸殘基的殘留伯氨基的量。相對于最初存在于同源毒素結構中的那些，在類毒素中將檢測到平均47％至54％的反應性氨基，其在與活化的Ps/LPS抗原的偶聯反應中作為親核基團。當將兩種類毒素的結構與鞏固的歷史的載體蛋白(如CRM197)的結構比較時，在偶聯反應中作為親核試劑競爭的能力方面，可以確定類毒素A具有約104氨基/摩爾(對于2,710AA，MW＝3.08x105)，而類毒素B具有約85氨基/摩爾(對于2,366AA，MW＝2.7x105)，使得它們的摩爾密度(其被定義為“摩爾親核活性”)在腸類毒素A中為3.84％，在細胞類毒素B中為3.60％，這兩個參數顯著低于對于在給定的偶聯反應中具有更高的作為親核試劑的能力的CRM197(7.47％)的計算值(如在國際專利申請號PCT/EP2014/051670中詳述的)。然而，考慮到兩種蛋白質類毒素的MW的顯著差異(在它們相對于CRM197的偏好中，基本上因子＝5.3和4.7)，對于在分子構建體中選擇的每種攜帶的碳水化合物抗原，當愿意限制多價制劑中載體蛋白/劑量的量時，蛋白質載體的摩爾比可能有利于類毒素。事實上，在兩種載體蛋白類毒素的相當重量劑量下，它們的摩爾數比CRM197低約5.0倍。因此，必須注意載體MW是影響綴合物的物理-化學特征的重要參數的事實，并且其可能限制獲得用于T輔助細胞依賴性在宿主免疫系統中的最佳誘導的值≥1.0的類毒素/特異性Ps/LPS的摩爾比的可能性。
表2列出了為本申請中詳述的工作合成的所有分子模型，代表用于此目的的各種化學計量，其取決于：i)所用載體蛋白的MW；ii)這種載體蛋白的摩爾親核活性(表達-NH2基團的量/蛋白質的摩爾數)；iii)活化的Ps/LPS抗原的平均MW，和iv)Ps/LPS抗原(DAB-MSE基團隨后與蛋白質的-NH2基團反應)的相應活化速率。示例的分子模型證明了所采用的化學法的靈活性以及載體蛋白可以以高于1.0和低于1.0的寬范圍的多種重量和摩爾比存在于綴合物實體中的事實。特別地，當考慮糖綴合物中存在的每種類型特異性或群特異性Ps時，蛋白質/Ps的摩爾比范圍為至少0.3至1.0，并且當考慮三種Ps的總和時，為至少0.3至1.0，每個Ps對最終存在于糖綴合物中的總量貢獻約三分之一。
表2
實施例9：攜帶多糖(傷寒沙門氏菌，豬霍亂沙門氏菌，大腸桿菌)或LPS/類內毒素(甲型副傷寒沙門氏菌，痢疾沙門氏菌，腸炎沙門氏菌)的腸內毒素A和細胞類毒素B(源自艱難梭菌的同源毒素)的抗原性多價分子構建體在動物模型中的免疫學分析
使用來自艱難梭菌的兩種蛋白質類毒素的兩種綴合物已經歷于用于主動免疫實驗的鼠動物模型中。作為輔助T-依賴性控制免疫原，CRM 197的同源綴合物用于平行實驗。
Ps-綴合物的疫苗制劑
組合PsVi、Ps0139和PsK1的腸類毒素A和細胞類毒素B綴合物。綴合物的化學計量特征顯示如上表1所示的蛋白質/每個類型特異性Ps的平均比為3.61±0.39(w/w)。
LPS/類內毒素-綴合物的疫苗制劑
組合腸炎沙門氏菌、痢疾沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌的LPS的腸類毒素A和細胞類毒素B綴合物。綴合物的化學計量特征顯示如上表1所示的蛋白質/每個類型特異性LPS/類內毒素的平均比為3.61±0.39(w/w)。
使用載體蛋白腸類毒素A和細胞類毒素B的Ps-綴合物和LPS(類內毒素)-綴合物的組合廣譜腸疫苗制劑
將PsVi、Ps0139和PsK1的腸類毒素A綴合物和腸炎沙門氏菌、痢疾沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌的LPS(內毒素)的細胞類毒素B綴合物組合用于此目的。
示例性疫苗的劑量和制劑
根據上表1中報道的分子構建體的化學計量，對于每個分子構建體中存在的每個Ps/LPS(類內毒素)綴合物和對于疫苗制劑中包含的每種類毒素(約3.0μg)，注射劑量為約1.0μg；當疫苗制劑含有用于相同或不同的三個一組的攜帶的Ps/LPS(類內毒素)抗原的組合的類毒素時(廣譜疫苗)，劑量變為總蛋白量的約6.0μg；將AlPO4用作固定劑量為0.5mg/劑量(相當于約0.120mg明礬)的佐劑。如通過抑制性ELISA所估計的，每個多價分子構建體對礦物佐劑的吸附以≥80重量％發生。
動物
對于以下報道的每個免疫實驗選擇的每組動物含有10只雌性Balb/c小鼠。
途徑
腹膜內。
免疫時間表
0、2、4周；在第0、2、4、6周出血。
基于高度純化的Ps抗原在哺乳動物中不具有顯著免疫原性并且在重復注射后不“加強”IgG同種型抗體的歷史知識，省略了使用普通Ps抗原的對照免疫。
ELISA滴度
滴度表示為對于每個類型特異性Ps/LPS(類內毒素)和兩種蛋白質類毒素相對于對照反應顯示O.D.≥2.0的終點反應。從1/200稀釋開始，以兩倍的方式連續進行血清池稀釋。
免疫結果
通過ELISA測定鼠血清池中的針對特異性Ps/LPS(類內毒素)或針對兩種類毒素中每一種的IgG的幾何平均滴度。SD在報告的幾何平均值的±25％以內。除非另有說明，血清滴度之間的統計顯著性(通過t檢驗確定)為<0.01。結果總結在下表3和4中。
同源毒素的體內中和
對于白喉毒素如Porro等人(1980)所述進行，對于艱難梭菌毒素如Pavliakova等人(2000)所述進行。
表3顯示小鼠對涉及腸類毒素A和細胞類毒素B作為用于大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌、傷寒沙門氏菌的Ps抗原的載體蛋白的分子模型的免疫應答。
表3
表4顯示小鼠對涉及腸類毒素A和細胞類毒素B作為用于腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、痢疾沙門氏菌的LPS/類內毒素抗原的分子模型的免疫應答。
表4
上表3和4中描述的結果顯示了對于兩種多價分子構建體(類毒素-Ps和類毒素-類內毒素多價綴合物)的四種組分中的每一種的生物學功能性IgG同種型抗體的記憶誘導。
特別地，對于攜帶的Ps抗原的每一種，平行地觀察到輔助T-依賴性抗原的典型和眾所周知的行為和針對載體蛋白觀察到的對免疫系統的任何增強活性。針對兩種類毒素獲得的增效作用和誘導的抗類毒素抗體的生物活性還強烈地支持這樣的事實，即多價分子構建體具有作為人類抗原的潛力，用于預防由于同源毒素引起的毒性。收集了在第二次加強劑量后獲得的血清GMT的以下結果，表示為相對于免疫前滴度的倍數增加，并在下表5中作為抗毒性滴度報告。
表5
雖然只關注一些具體實例，上述詳細的結果支持用于在哺乳動物宿主中誘導針對艱難梭菌的載體蛋白腸類毒素A和細胞類毒素B以及針對攜帶的大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和攜帶的甲型副傷寒沙門氏菌、痢疾沙門氏菌、腸炎沙門氏菌的類內毒素的免疫的廣譜腸疫苗的制備和使用。基于上述，根據詳細的分子構建體，艱難梭菌的莢膜Ps也可以被認為是由同源病原體的兩種類毒素攜帶的Ps抗原。
如在實施例8和9中報道的廣譜疫苗的制劑具有關于疫苗制劑的客觀優點，其考慮了兩種類毒素蛋白的每一種的六種不同Ps/LPS(類內毒素)綴合物中的每一種的簡單和最終的聯合：
A)通過使用具有內置多個表位的分子模型，實際上可以減少存在于廣譜制劑中的載體蛋白的量(例如：僅使用兩個三個一組的綴合物確實將蛋白質載體的量減少至存在于六個綴合物的聯合制劑中的載體蛋白的量的1/3或33％)。
B)注射次數將減少到總共3次注射，除了所涉及的哺乳動物宿主的較低應激之外，還明顯節省的材料和資源(對于六種個體類型特異性疫苗中的每一種，最少3次注射(一次引發劑量和兩次加強劑量)，將導致總共18次注射)。
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