限公司提供。 陽0%] 2實驗方法 2. 1菌懸液的制備 蠟樣芽抱桿菌經活化后，接種于無菌肉湯培養基中，37 °C培養12h至活菌數為1〇8CFU/mU備用。
[0027] 2. 2生物被膜的制備 (1)載體片的清洗：將載體片用自然水沖洗，放在丙酬中超聲15min(超聲頻率40曲Z， 超聲功率250W)，除去表面油污；然后，將其置于75%乙醇中浸泡30min,隨后用洗涂劑清 洗，最后用蒸饋水沖洗干凈，烘干后滅菌備用。
[00測 （2)生物被膜的培養：向試管中加入載體片和10mL肉湯培養基，滅菌后，接入1% 的上述菌懸液（IO8CFU/mL)，于37 °C下培養。
[0029] 2. 3生物被膜活菌數的測定 生物被膜菌數按下列公式計算：
采用超聲平板菌落計數法：生物被膜培養一定時間后，倒掉試管中的液體培養液，然后 用無菌PBS(0.05M，pH7. 2)漂洗3次，除去浮游菌和粘附不牢的菌，再用無菌移液管加入 10血無菌PBS(0.05M，pH7. 2)，并超聲15min(250W)，隨后對菌懸液進行平板菌落計 數，平行試驗3次，統計學分析使用MicrosoftOfficeExcel軟件。
[0030] 實施例1。
[0031] 分別稱取0. 05g對徑基苯甲酸乙醋和0. 05g乙二胺四乙酸二鋼，添加至1000血濃 度為30%的乙醇溶液中，待充分溶解后，即獲得濃度為0.Ig/L的防腐劑組合物。 陽0巧 實施例2。
[0033] 分別稱取0. 03g對徑基苯甲酸乙醋和0. 02g乙二胺四乙酸二鋼，添加至1000血濃 度為30%的乙醇溶液中，待充分溶解后，即獲得濃度為0. 05g/L的防腐劑組合物。
[0034] 實施例3。
[0035] 分別稱取0.Olg對徑基苯甲酸乙醋和0.Olg乙二胺四乙酸二鋼，添加至1000 mL濃 度為30%的乙醇溶液中，待充分溶解后，即獲得濃度為0. 02g/L的防腐劑組合物。
[0036] 對比例1。
[0037] 分別稱取0. 0005g對徑基苯甲酸乙醋和0. 0005g乙二胺四乙酸二鋼，添加至 1000 mL濃度為30%的乙醇溶液中，待充分溶解后，即獲得濃度為0. 00Ig/L的防腐劑組合物。 陽0測 對比例2。
[0039] 分別稱取0. 05g對徑基苯甲酸乙醋和0. 05g山梨酸鐘，添加至1000血濃度為30% 的乙醇溶液中，待充分溶解后，即獲得濃度為0.Ig/L的添加劑組合物。 W40] 對比例3。
[0041] 分別稱取0. 05g對徑基苯甲酸乙醋和0. 05g苯甲酸，添加至1000血濃度為30%的 乙醇溶液中，待充分溶解后，即獲得濃度為0.Ig/L的添加劑組合物。
[0042] 試驗結果及分析： (一）本發明的防腐劑組合物對蠟樣芽抱桿菌生物被膜形成的抑制效果 分別取實施例1至3W及對比例1至3的防腐劑組合物1血，分別加入裝有9血肉 湯培養基和不誘鋼片的試管中，W30%乙醇溶液為空白，WO. 1g/L的對徑基苯甲酸乙醋單 獨使用為對照組1，W0.1g/L的乙二胺四乙酸二鋼單獨使用為對照組2。滅菌后，接入1% 密度為IO8CFU/mL的蠟樣芽抱桿菌菌懸液，37°C培養24h，采用超聲平板菌落計數法對不 誘鋼片上的生物被膜菌進行計數。實施例1至3的防腐劑組合物對蠟樣芽抱桿菌生物被膜 形成的影響如表1所示。
[0043] 表1實施例1至3的防腐劑組合物與對比例1至3的添加劑組合物抑制生物被膜 的效果對比
從表1可W看出： (1)對比例1的濃度為0.OOlg/L的防腐劑組合物對蠟樣芽抱桿菌生物被膜的形成基本 沒有抑制效果。當防腐劑組合物的濃度增加到0. 〇2g/L(實施例3)，其抑制效果顯現，并且 隨著濃度繼續增大，抑制效果不斷增強。當防腐劑組合物的濃度達到的0.Ig/L(實施例1) 時，抑制效果最強，蠟樣芽抱桿菌生物被膜中的活菌數下降至0.54logCRJ/cm2。運表明本 發明的防腐劑組合物對蠟樣芽抱桿菌生物被膜的形成有顯著的抑制作用。
[0044] (2)分別W0. 1g/L的對徑基苯甲酸乙醋和0. 1g/L的乙二胺四乙酸二鋼單獨使 用為對照，其生物被膜的活菌數分別為2. 49和3. 01，顯然乙二胺四乙酸二鋼單獨使用對 生物被膜抑制效果非常弱；另一方面，當對徑基苯甲酸乙醋和山梨酸鐘所組成的添加劑組 合物(對比例2)W及對徑基苯甲酸乙醋和苯甲酸所組成的添加劑組合物(對比例3)，其不 僅對蠟樣芽抱桿菌生物被膜的形成無協同抑制效應，而且有括抗效應；然而，本發明的防腐 劑組合物，即對徑基苯甲酸乙醋和乙二胺四乙酸二鋼二者復合使用時，二者對生物被膜表 現出強烈的協同抑制效應，生物被膜的活菌數分別降至0.54logCRJ/cm2 (實施例1)、0.72 logCFU/cm2 (實施例2)和0. 84logCFU/cm2 (實施例3)，其遠低于單獨使用對徑基苯甲酸 乙醋的對應值2. 49logCFU/cm2 (對照組1)和單獨使用乙二胺四乙酸二鋼的對應值3.Ol (對照組2)。運說明本發明的防腐劑組合物對蠟樣芽抱桿菌生物被膜有強烈的協同抑制效 應。
[0045] (二）本發明的防腐劑組合物對蠟樣芽抱桿菌生物被膜生長的影響 將實施例1和對比例1的防腐劑組合物，分別于肉湯培養基中培養蠟樣芽抱桿菌生物 被膜，每隔3h測生物被膜中的活菌數，生長曲線如圖1所示。在對比例1的條件下，0-21 h蠟樣芽抱桿菌生物被膜中的活菌數呈顯著上升趨勢（尸<0. 05),21-24h被膜中的活菌數 增加緩慢；培養24h后，被膜中的活菌數為4. 56logCFU/cm2。而在實施例1的條件下， 0-12h蠟樣芽抱桿菌生物被膜中的活菌數顯著增加（尸< 0. 05),12-24h被膜中的活菌數 增加緩慢，24h時活菌數達2. 71logCRJ/cm2。運表明尼泊金乙醋的加入對蠟樣芽抱桿菌 生物被膜的形成有顯著的抑制作用，并且大大縮短了生物被膜生長的對數生長期，促進了 穩定期的出現。
[0046] 結論： 1) 本發明的防腐劑組合物中，對徑基苯甲酸乙醋和乙二胺四乙酸二鋼復合使用，能夠 對食源性致病菌生物被膜產生強烈的協同抑制效應，從而具有顯著抑制食源性致病菌生物 被膜形成的功效； 2) 本發明的防腐劑組合物安全性好，具有高效、低毒、廣譜、易配伍、低成本的優點，而 且該防腐劑組合物的濃度為0. 02~0.Ig/l，其符合國家對食品添加劑的用量要求，其在低濃 度范圍內即具有顯著抑制食源性致病菌生物被膜的作用，運對于在保障食品合理保存期的 前提下盡可能少地使用防腐劑、增加食品的安全性W及降低產品成本是具有積極意義的； 3) 本發明提供了防腐劑組合物在抑制食源性致病菌生物被膜形成的新用途，可用于制 備抑制食源性致病菌生物被膜形成的藥物、食品添加劑W及飼料添加劑，為食品工業中生 物被膜的控制、清除提供了新的途徑，進而為食品的安全性提供可靠的保障。
[0047] 最后應當說明的是，W上實施例僅用于說明本發明的技術方案而非對本發明保護 范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理 解，可W對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和 范圍。
【主權項】
1. 防腐劑組合物，其特征在于：所述防腐劑組合物是用于抑制食源性病原菌生物被膜 形成，其包括以下組分： 對羥基苯甲酸乙酯0. 005~0.lg; 乙二胺四乙酸二鈉〇· 005~0·lg; 溶劑每l〇〇〇mL; 其中： 所述溶劑為濃度為20%~35%的乙醇溶液； 所述對羥基苯甲酸乙酯和所述乙二胺四乙酸二鈉的質量比為〇. 5~1:0. 5~1 ; 其制備方法如下： 按配比將對羥基苯甲酸乙酯和乙二胺四乙酸二鈉依次添加至溶劑中，待充分溶解后， 即獲得所述防腐劑組合物。2. 根據權利要求1所述的防腐劑組合物，其特征在于：所述防腐劑組合物包括以下組 分： 對羥基苯甲酸乙酯0. 〇l~〇.lg; 乙二胺四乙酸二鈉〇.〇l~〇.lg; 溶劑每lOOOrnL。3. 根據權利要求2所述的防腐劑組合物，其特征在于：所述防腐劑組合物包括以下組 分： 對羥基苯甲酸乙酯0. 05g; 乙二胺四乙酸二鈉0.05g; 溶劑每l〇〇〇mL。4. 根據權利要求2所述的防腐劑組合物，其特征在于：所述防腐劑組合物包括以下組 分： 對羥基苯甲酸乙酯0.03g; 乙二胺四乙酸二鈉0.02g; 溶劑每l〇〇〇mL。5. 根據權利要求2所述的防腐劑組合物，其特征在于：所述防腐劑組合物中，對羥基苯 甲酸乙酯和乙二胺四乙酸二鈉的質量比為1:1。6. 根據權利要求1所述的防腐劑組合物，其特征在于：所述防腐劑組合物的pH值為 4~8〇7. 權利要求1至6任意一項所述的防腐劑組合物用于抑制食源性致病菌生物被膜形成 的新用途。8. 根據權利要求7所述的防腐劑組合物用于抑制食源性致病菌生物被膜形成的新用 途，其特征在于：所述防腐劑組合物在制備抑制食源性致病菌生物被膜形成的藥物或食品 添加劑組中的應用。9. 根據權利要求7所述的防腐劑組合物用于抑制食源性致病菌生物被膜形成的新用 途，其特征在于：所述防腐劑組合物在制備抑制食源性致病菌生物被膜形成的飼料添加劑 中的應用。10. 根據權利要求7所述的防腐劑組合物用于抑制食源性致病菌生物被膜形成的新用 途，其特征在于：所述食源性致病菌生物被膜為蠟樣芽孢桿菌生物被膜。
【專利摘要】本發明涉及食品添加劑技術領域，具體涉及一種防腐劑組合物及其用途，其中是由每1000mL溶劑中含有0.005~0.1g對羥基苯甲酸乙酯和0.005~0.1g乙二胺四乙酸二鈉經過混合而成，對羥基苯甲酸乙酯和乙二胺四乙酸二鈉的質量比為0.5~1:0.5~1的防腐劑組合物。與現有技術相比，本發明的防腐劑組合物能夠對食源性致病菌生物被膜產生強烈的抑制效應，本發明提供了防腐劑組合物在抑制食源性致病菌生物被膜形成的新用途，可用于制備抑制食源性致病菌生物被膜形成的藥物、食品添加劑以及飼料添加劑，為食品工業中生物被膜的控制、清除提供了新的途徑，進而為食品的安全性提供可靠的保障。
【IPC分類】A61K47/18, A23L3/3526, A61K47/14
【公開號】CN105341622
【申請號】CN201510675099
【發明人】李南薇, 劉功良, 高蘇娟, 劉銳
【申請人】仲愷農業工程學院
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年10月19日