具有產量增加潛能的植物生長相關enox蛋白、序列和方法
【專利說明】具有產量増加潛能的植物生長相關ENOX蛋白、序列和方法 發明領域
[0001]在某些方面，本發明設及基因工程、分子生物學、植物生物學、細菌學和農業領域。 [醒]發明背景 由于許多因素如天氣、昆蟲或其它動物侵襲，農民可能遭受低作物產量或作物歉收。當 此發生時，其可對農民具有經濟影響。有時，由于運樣的事件農民可能希望重新種植一種作 物來減輕其損失。在其它時候，農民可能只是希望通過種植第二種作物來增加其生產力。
[0003] 在單個季節內種植一種或多種作物的運種實踐被稱為"雙作"或"復種"。復種允許 農民在給定的季節使用相同數量的±地同時增加其生產力。
[0004] 然而，取決于計時，在季節內可能沒有足夠的剩余時間使第二種作物成熟。因此， 成功的復種季節需要小屯、管理作物的種植日期和收獲日期。
[0005] 種植的第二種作物可與種植的第一種作物相同，或其可為不同的。例如，可在第一 批大豆或第一批小麥之后種植第二批大豆。
[0006] 根據該背景，存在對具有增加的產量和/或減少的成熟時間的改善的和/或備選的 農產品的需求。本發明的各方面致力于運些需求。
[0007] 發明概述 在某些實施方案中，本發明描述了來自琴葉擬南芥(Arabidopsis Iyrata)的植物候選 組成型ENOX (CNOX或ENOXl)蛋白的克隆、表達和表征。編碼該335 (165)個氨基酸的蛋白的 基因參見登錄號XP-002882467。先前通過定點誘變鑒定并且存在于植物的候選ENOXl蛋白 中的ENOX蛋白的特征性功能基序包括腺嚷嶺核巧酸和銅結合基序連同必需的半脫氨酸。然 而，人EN0X2的藥物結合基序化EMTE)序列缺失。在大腸桿菌中表達的重組蛋白的活性不受 辣椒素、EGCg和其它EN0X2-抑制物質影響。用NAD(P化和還原型輔酶Q二者作為底物均顯示 周期性氧化活性。結合的銅對于活性必不可少并且活性受到ENOXl-特異性抑制劑苦木內醋 D抑制。稱黑激素的加入使24 min周期相位同步(phase)W致下一個完整的周期在稱黑激素 加入后24 min開始，如同是一般性ENOXl活性所特有的。周期性蛋白二硫鍵-琉基互換活性 (disulfide-thiol interchange activity)連同24 min ENOXl蛋白周期特有的2氧化加3 互換活性模式也得到證明。純化的植物ENOXl蛋白的濃縮溶液形成不可溶的聚集體，缺乏酶 活性，與淀粉樣蛋白相似。聚集的制備物通過等電聚焦恢復活性。上述特征與哺乳動物 ENOXl的那些類似，使來自擬南芥屬(Arabidopsis)的ENOXl成為植物中過表達的理想候選， 作為增加生物量和產量的手段。
[000引在某些方面，本發明設及在雜種生物體，例如，但不限于細菌、植物和植物種子中 克隆、轉染和表達ENOX蛋白。
[0009]另外，本發明的實施方案描述了通過向植物施用ENOXl的小分子量激活劑增加植 物產量的方法。指定為TR-III，優選半脫氨酸的激活劑作為葉面噴灑W約0.005-1.0磅/英 畝Qb/A)的量施用。優選地，施用0.01化/A的半脫氨酸。此外，本發明提供增強植物生長的 方法，所述方法包括作為種子處理向植物種子施用半脫氨酸。半脫氨酸W約0.001-1 mg/g 合適載體(mg/g)例如滑石的量施用到種子。優選地，半脫氨酸在0.002-0.02 mg/g滑石的范 圍之間施用。本發明還提供增強植物根生長和莖直徑(增加的站立能力）的方法，其包括向 植物施用半脫氨酸。半脫氨酸W約0.005-1.0化/A的量施用。優選地，給植物施用O. Ol化/ A的半脫氨酸。
[0010] 在另一個實施方案中，本發明公開了植物候選組成型ENOX蛋白的克隆、表達和表 征，在某些實施方案中所述蛋白被天然（IAA)和合成的（2,4-二氯苯氧乙酸，2,4-D)生長素 植物生長調節因子W約1 iiM的最適條件激活，并且更高的濃度不太有效。先前通過定點誘 變鑒定并且在候選的生長素-激活的ENOX (dNOX)中存在的植物ENOXl蛋白的特征性功能基 序，除了先前鑒定的生長素結合基序外還包括腺嚷嶺核巧酸和銅結合基序連同必需的半脫 氨酸。通過氧化的[NAD(P)H和還原型輔酶Q作為底物]均顯示周期性氧化活性，W及對于蛋 白二硫鍵互換，產生其它生長-相關ENOX蛋白的24 min周期性特征性的2氧化加3互換活性 模式。結合的銅對于活性必不可少并且活性受至化NOXl-特異性抑制劑苦木內醋D抑制。制備 物在生長素不存在時缺乏活性。無活性的生長素2,3-D無效，如EN0X2抑制劑一樣。純化的植 物ENOXl蛋白的濃縮溶液形成不可溶的聚集體，缺乏酶活性，與淀粉樣蛋白相似。聚集的制 備物通過等電聚焦恢復活性。上述與哺乳動物ENOXl的那些類似的特征使植物dNOX成為在 植物中過表達的第二候選，作為增加生物量和產量的手段。
[0011] 在此隨附的權利要求書中提供了另外的概述，其各自被認為是本發明的一個實施 方案的概述。
[0012] 本發明前述和又進一步的方面將從下列詳述和附圖變得更顯而易見。
[001引 附圖簡述 圖1.細胞生長與ENOXl活性相關。
[0014] 圖2.人ENOXl過表達增加細胞大小。
[0015] 圖3. NCBI參考序列：XI^_002882467.1 (沈Q ID NO 5)。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) YML117W (沈Q ID NO: 6)與擬南芥屬ENOXl (SEQ ID NO: 7)的比對。重組擬 南芥屬ENOXl氨基酸84-126與YML117W氨基酸932-968之間存在37% (16/43)的同一性和58% (25/43)的相似性。
[0016] 圖4.在銀染色的15% SDS-PAGE上顯示的14 kD重組擬南芥屬ENOXl的表達。泳道1 和2:祀TlIa-AraENOXl轉化的大腸桿菌的全細胞(2 );泳道3:弗式壓碎器壓碎的祀TlIa- Ar址NOXl轉化的大腸桿菌的沉淀(2 yl)。表達的重組擬南芥屬ENOXl (箭頭)存在于弗式壓 碎器壓碎的大腸桿菌的沉淀中。
[0017] 圖5.對于IEF純化的擬南芥屬ENOXl的級分顯示12 min期間對作為NADH消耗的量 度的A34日減少的連續跟蹤。測定條件如(Jiang, Z., Gorenstein, N. M., Morr自，D. M.和 Morr自，D. J. 2008.Biochemistry 47:14028-14038)所描述的，不同之處在于NADH濃度為 0.75 ml和使用S陽CTRA max 340PC微板閱讀器自動收集和存儲數據。混合物在200山的總 體積中包含大約20 yg ENOXl。
[0018] 圖6. IEF-純化的重組擬南芥屬ENOXl的NADH氧化酶活性。圖示了5個極大值的振 蕩模式。相隔6 min的主要極大值由標記為1和2的極大值指示。之后的=個次要的極大值與 主要的極大值分離并且彼此相隔4.5 min,建立了24 min的周期[6 + (4.5 X 4) = 24]。
[0019] 圖7. IEF-純化的重組擬南芥屬ENOXl的NADH氧化酶活性和對1 yM稱黑激素的反 應。加入稱黑激素后，新的極大值在稱黑激素加入(箭頭)之后24 min出現，其為ENOXl的一 個特征。
[0020] 圖8.從二硫代二化晚(DTDP)底物的裂解測量的IEF-純化的重組擬南芥屬ENOXl 的蛋白二硫鍵-琉基互換活性。觀察到振蕩的活性，活性與相隔4.5 min的=個極大值而非 相隔6 min的兩個極大值最密切相關。
[002。 圖9.通過A"q(A)的增加或A29Q (B)的減少測量的重組擬南芥屬ENOXl氧化氨釀 (還原型輔酶Q)的能力。如圖6的NADH氧化一樣，活性振蕩，具有相隔6 min的突出的極大值 (箭頭），W建立包含相隔4.5 min的3個額外的極大值(總計5個極大值)的24 min周期。
[0022] 圖10.通過等電聚焦，純化和活化重組擬南芥屬ENOXl。
[0023] 圖11.特異性ENOXl苦木苦味素抑制劑苦木內醋D對重組擬南芥屬ENOXl的抑制。
[0024] 圖12.用TFA +浴銅靈減小的重組擬南芥屬ENOXl的NADH氧化酶活性。A.在TFA 的存在下，24 min的周期未受影響。B.當用TFA和浴銅靈測定時，24 min的周期大大減少。 C.通過透析去除浴銅靈和重新加入銅恢復全部的活性。
[0025] 圖13.當在〇2〇中測定時擬南芥屬ENOXl的NADH氧化酶活性顯示24 min至30 min 的周期長度增加。重水增加周期長度的作用為生物鐘的標志之一。
[00%] 圖14.半脫氨酸對NADH氧化的刺激對在細菌中表達的重組ENOXl蛋白的ENOXl活 性周期的極大值③特異。
[0027] 圖15.使大豆種子于黑暗中在賠石中發芽并收集恰在鉤部分化OOk)下方的2 cm 下胚軸切片。將運些均質化，制備質膜，并測定ENOXl活性。
[0028] 圖16.如圖15中，除了在溫室中生長1個月后的大豆植物的葉組織(第一和第二個 S葉)外。
[0029] 圖17.使大豆植物種子于黑暗中在賠石中發芽，7天后，從根上方切除幼苗并放置 在光照中的小瓶所包含的水中。
[0030] 圖18.如圖17中，不同之處在于使未處理的種子發芽和將切除的芽轉移至在水中 制備的不同濃度的TR-III溶液中。
[0031] 圖19.植物在溫室中自處理的種子生長。
[0032] 圖20.如圖19中，不同之處在于植物來自未處理的種子和用不同比率的TR-III噴 霧。該實驗仍在進行中但在0.01化/A TR-III時觀察到上胚軸增大，與過去一樣，0.001或 0.1化/A作用很小或無作用。
[0033] 圖21.田間實驗中每棵大豆植物的豆芙，該實驗比較了無 TR-III (實屯、符號)與7 月3日作為葉面噴灑施用的0.01化/A TR-III (開符號，虛線）。
[0034] 圖22.比較無 TR-III、TR-III 1:50和TR-III 1:500,從用滑石處理的種子生長的 植物的大豆莖的次生木質部的增加。
[00對圖23.來自圖21的田間實驗的大豆的站立能力。無 TR-III植物(左)嚴重倒伏。TR-III處理的植物(右)不倒伏。
[0036] 圖24.重組生長素-活化的ENOX蛋白（ABP-20)的序列（SEQ ID NO: 8)。
[0037] 圖25.在銀染色的15% SDS-PAGE上顯示的20 kD重組ABP-20的表達。泳道1:攜帶 載體祀T-Ub的全細胞;泳道2:祀Tl A-ABP-20轉化的大腸桿菌的全細胞(2 y 1);泳道3:弗 式壓碎器壓碎的祀Tl A-ABP-20轉化的大腸桿菌的上清液(2 yl);泳道4:弗式壓碎器壓碎 的祀TUb-ABP-20轉化的大腸桿菌的沉淀(2 yl)。表達的重組ABP-20存在于弗式壓碎器壓 碎的大腸桿菌的沉淀中（箭頭）。
[003引圖26. IEF純化的重組ABP-20的NADH氧化酶活性。在60 min時加入2,4-二氯苯氧 乙酸（2,4-D) (1 yM)W活化該酶。圖示了5個極大值的振蕩模式。相隔6 min的主要極大值 由單箭頭指示。之后的=個次要極大值與主要極大值分離并彼此相隔4.5 min,建立了24 min的周期[6 + (4.5 X 4)] = 24]。
[0039] 圖27.如圖26,不同之處在于通過60 m