新型雙孔免疫側向層析測試卡的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫學臨床免疫分析技術領域，尤其涉及一種新型雙孔免疫側向層析測試卡。
【背景技術】
[0002]腫瘤是一種常見病和多發病，發病率居第二位。據世界衛生組織1997年報告稱全球腫瘤患者每年死亡人數高達660萬，到2020年全球的腫瘤患者將達到1500萬。各種惡性腫瘤嚴重地威脅著人類的身體健康。
[0003]目前研究人員已經發現了多種與惡性腫瘤相關的標志物，例如AFP(甲胎蛋白)、CEA(癌胚抗原)、CA15 — 3、CA19 — 9、CA50、CA125、PSA等等。然而，這些腫瘤相關標志物均為單功能標志物。利用單功能腫瘤標志物只能檢測其對應的一類腫瘤，對其它腫瘤則無能為力。如果要檢查體內是否存在某些常見的惡性腫瘤就必須作多項檢查。
[0004]1987年Geraghty等(I)發現并克隆了HLA—G13HLA-G是人類白細胞抗原(HLA)I組中非經典的組織相容性抗原。在正常人體中不存在。初期有關HLA—G的研究集中于胎兒同母親之間的免疫耐受(2)近20年，HLA—G已成為重要的免疫分子，在免疫、生殖、腫瘤、器官移植等方面發揮著重要作用(3)。免疫組化檢測結果證實在喉癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌等多種惡性腫瘤組織中都能表達HLA—G。大量的實驗證明，HLA-G是一個具有高度腫瘤特異性的腫瘤標志物，在惡性腫瘤表達具有普遍性。在惡性腫瘤發生和發展過程中其水平在血液、其它體液及腫瘤組織中增高。因此檢測HLA-G能廣泛地應用于診斷各種常見的惡性腫瘤。通過檢測HLA-G便可探明受檢者體內是否存在常見的惡性腫瘤。
[0005]由于在腫瘤發病的早期往往沒有自覺癥狀，不能引起人們的警覺。可是一旦發覺自覺癥狀到醫院看病時已到無法根治的中晚期。如果在腫瘤發病的早期，在未發覺自覺癥狀之前能夠早期發現早期腫瘤，進行早期治療，就能獲得根治。為了實現早發現早治療的目標開展腫瘤基層普查是必要的。但是由于缺乏基層普查的技術，所以很難開展腫瘤基層普查。并且目前檢測腫瘤常用的設備比較復雜，在實驗室內需要專人操作，不適合基層流動性工作。
[0006]側向免疫分析是一種簡便、快速、廉價、可自檢自測的技術，很適合在基層篩查早期腫瘤。
[0007]金標技術制備的金顆粒直徑大小往往不均一，直徑不均一的金顆粒在層析過程中運動速度不同，于是導致拖尾現象。另外金顆粒不穩定，容易凝聚或沉淀導致試劑失效。第三，標記蛋白的方法很繁瑣。
【發明內容】
[0008]有鑒于此，本發明實施例提供一種雙孔免疫側向層析測試卡，主要目的是提高測試卡檢測HLA-G的準確度及側向層析試劑的穩定性。
[0009]為達到上述目的，本發明主要提供如下技術方案:
[0010]—方面，本發明實施例提供了一種新型雙孔免疫側向層析測試卡，利用廣譜腫瘤標志物HLA-G的抗體為主，以癌胚抗原CEA的抗體和乙肝表面抗原HBsAg的抗體作為參照物，通過三種抗體聯合檢測HLA-G，組成篩查癌癥的新型雙孔免疫側向層析測試卡。
[0011]作為優選，所述雙孔免疫側向層析測試卡以三種抗體聯合檢測HLA-G。所述測試卡的A孔窗口設置Tl和T2標志，B孔窗口設置T3和C的標志。
[0012]作為優選，以廣譜腫瘤標志物HLA-G的抗體為主，輔以CEA、HBsAg的抗體，組成三種抗體聯合檢測HLA-G的測試卡。
[0013]作為優選，使用HBsAg的抗體，可以掌控由HBsAg引起的非特異交叉反應產生的假陽性。
[0014]作為優選，使用常用腫瘤標志物CEA的抗體，以彌補HLA-G產生的假陰性。
[0015]作為優選，測試卡采用三種抗體聯合檢測HLA-G，可以管控假陽性和假陰性結果，式測試卡具有更高的準確度。
[0016]作為優選，HLA-G和CEA的標記抗體Al和A2分別設置在A孔附近;HBsAg的標記抗體A3設置在B孔附近。
[0017]作為優選，T1、T2和T3標志分別固定HLA-G、CEA和HBsAg的捕獲抗體B1、B2和B3。
[0018]作為優選，當A孔和B孔加入待測血清后，標記抗體A1、A2、A3分別與相應的抗原結合后形成彩色免疫復合物，沿著NC膜向前移動，當到達T1、T2、T3標志處，與固定在這里的捕獲抗體Β1、Β2和Β3分別結合形成鮮亮的彩色線條。根據待測血清中所含三種抗原存在與否，表現在Tl、Τ2、Τ3標志處有無彩色線條形成，由此可以得到測試卡檢測HLA-G的結果。依據制定的判斷標準，可以掌控假陽性和假陰性，準確判斷有無HLA-G。
[0019]作為優選，測試卡所用的抗體A為兔抗體。當過量的彩標記抗體A到達C標志處，彩標抗體A與固定在C處的羊抗兔IgG結合形成彩色線條，表示試劑有效。
[0020]采用三種抗體聯合檢測HLA-G的新型雙孔免疫側向層析測試卡可掌控假陽性和假陰性結果，有效提高檢測HLA-G的準確度。
[0021]作為優選，所述測試卡采用彩色高分子微球代替傳統側向層析的金顆粒與被測抗原的抗體A結合形成彩色的標記抗體A。
[0022]作為優選，所述彩色高分子微球上具有羧基或氨基。
[0023]作為優選，所述高分子微球的直徑為10-150納米。
[0024]作為優選，所述彩色高分子微球采用市售的彩色高分子微球，所述彩色高分子微球帶有羧基或氨基，與水溶性碳二亞胺(EDC)作用，使高分子彩色微球與蛋白或多肽結合，使蛋白或多肽標記上彩色高分子微球，形成彩色免疫微球，用于免疫側向層析測定;高分子微球或與戊二醛作用，使其與蛋白或多肽結合，使蛋白或多肽標記上彩色高分子微球，形成了彩色免疫微球，用于免疫側向層析測定。
[0025]作為優選，所述彩色免疫微球的制備方法，包括如下步驟:
[0026](I)選擇直徑合適的彩色高分子微球，彩色高分子微球的直徑通常在10-150納米之間；
[0027](2)單抗々先經?!18.0-9.0，0.0111101/1 tris-HCL緩沖液透析，過夜后離心除去變性蛋白沉淀備用；
[0028](3)高分子微球懸在pH8.0-9.0，0.0lmol/L tris-HCL緩沖液中，在蛋白交聯劑炭二亞胺(EDC)、N-羥基硫代琥柏酰亞胺或己二酸二酰肼存在下，在不斷攪拌下，滴入除去變形蛋白沉淀的單抗A;加完單抗A后繼續攪拌10分鐘，然后加入PEG20000 (聚乙二醇20000)，使PEG20000在緩沖溶液中最終濃度達到0.1 %以穩定高分子微球與單抗A結合形成的彩色的標記抗體A，繼續反應20分鐘至I小時；
[0029](4)洗滌:彩色免疫微球用pH8.0-9.0,0.0lmol/L Tris-HCL緩沖液離心洗滌兩次，所述緩沖液中PEG20000的濃度為1% ;
[°03°] (5)在標記物離心沉淀中加入10毫升pH8.0-9.0,0.0lmol/L tris-HCL緩沖液，再往其中加牛血清白蛋白(BSA)達I %，再加入占總體積50%的甘油，疊氮鈉防腐，4度冰箱保存備用。
[0031]與現有技術相比，本發明的有益效果在于:
[0032]本發明實施例采用三種抗體聯合檢測HLA-G的新型雙孔免疫側向層析測試卡，可掌控假陽性和假陰性結果，可有效提高檢測HLA-G的準確度。
[0033]彩色帶有活性基團的高分子微球與抗體共價鍵結合形成彩色免疫微球。彩色微球標記抗體極為簡單快速，標記抗體后十分穩定不易凝聚或沉淀。用彩色高分子微球代替金顆粒用于免疫側向層析取得了很好效果。
【附圖說明】
[0034]圖1為本發明實施例的新型雙孔免疫側向層析測試卡的結構示意圖。
【具體實施方式】
[0035]下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細描述，但不作為對本發明的限定。在下述說明中，不同的“一實施例”或“實施例”指的不一定是同一實施例。此外，一或多個實施例中的特定特征、結構、或特點可由任何合適形式組合。
[0036]實施例1:用紅色聚苯乙烯微球標記HLA-G單抗Al
[0037](I)準備彩色聚苯乙烯微球:采用市售紅色聚苯乙烯微球，直徑在10-150納米，其上帶有活潑羧基或氨基；
[0038](2)HLA-G單抗Al先經pH8.0-9.0,0.0lmol/L tris-HCL緩沖液透析過夜，然后離心除去變型蛋白沉淀備用；
[0039](3)將聚苯乙烯彩色微球懸在pH8.0-9.0,0.01mol/L tris-HCL緩沖液中，在蛋白交聯劑炭二亞胺(EDC)、N-羥基硫代琥柏酰亞胺、己二酸二酰肼等存在下，在不斷攪拌下，滴入HLA-G單抗Al ；加完HLA-G單抗Al后繼續攪拌10分鐘，然后加入PEG20000，使PEG20000在緩沖液中的最終濃度達到0.1 %以穩定彩色免疫微球;繼續反應20分鐘至I小時；
[0040](4)洗滌:標記物用pH8.0-9.0,0.0lmol/L Tris-HCL緩沖液洗滌兩次，緩沖液中PEG20000的濃度為1%;
[0041 ] (5)在標記物離心沉淀中加入10毫升pH8.0-9.0,0.0lmol/L tris-HCL緩沖液，再往其中加BSA達I %，再加入體積占50%的甘油，以疊氮鈉防腐，4度冰箱保存備用。也可在-20攝氏度冰箱保存一年以上。
[0042]實施例2:新型雙孔免疫側向層析測試卡(簡稱測試卡)的制備
[0043](I)準備HLA-G、CEA、HBsAg三者的標記抗體Al、A2、A3。把標記抗體A1、A2設置在A孔附近的玻纖膜上，標記抗體A3設置在B孔附近的玻纖膜上。請參閱附圖1。
[0044](2)準備HLA-G、CEA、HBsAg三者的捕獲抗體B1、B2、B3。把捕獲抗體B1、B2固定住A孔窗口的Tl、T2標志處的NC膜上。把捕獲抗體B3固定在B孔窗口的Τ3