豬瘟兔化弱毒疫苗病毒效力測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及動物生物制品領域，具體而言，涉及一種豬瘟兔化弱毒疫苗病毒效力 測定方法。
【背景技術】
[0002] 豬痕（Classical Swine Fever，CSF)是由豬痕病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一類高發病率的高度接觸性傳染病。該病被0ΙΕ列為A類傳染病之一，是 國際畜牧獸醫產品貿易重要檢疫對象。家豬和野豬是CSFV的唯一自然宿主。針對該病尚無 有效的治療藥物，通常應用疫苗免疫進行預防，目前，國內廣泛使用豬瘟兔化弱毒疫苗來預 防豬瘟的發生。
[0003] CSF臨床記載發現于19世紀初期，1903年被證實為病毒感染所致。CSFV感染后導致 的病理變化及病程與感染豬的年齡、健康狀況、飼養環境和免疫狀態息息相關，但更大程度 卻決于CSFV毒株的毒力強弱。由于豬瘟兔化弱毒疫苗是經家兔傳代致弱而來，該病毒注射 到家兔體內可以使家兔呈現暫時性的發熱反應(兔體熱反應實驗），因此在很長一段時間， 疫苗生產企業均使用兔體熱反應法對疫苗的半成品和成品進行疫苗含量的測定。到目前為 止兔體熱反應發依然是我國豬瘟疫苗生產企業使用最多的方法。但是在使用該方法時需要 選擇純系大耳白兔進行，實驗周期最少需要7天，豬瘟疫苗注射入家兔體內后需要連續對家 兔進行每天4次的體溫測定，這一方法耗時，耗力，存在嚴重不足，亟需更先進有效的方法提 高檢測效率。
[0004] 除此之外，目前可以對豬瘟兔化弱毒進行定量的方法還有抗原捕獲ELISA方法、免 疫熒光檢查法、反轉錄聚合酶鏈式反應法(RT-PCR)或實時反轉錄定量PCR(Real-Time PCR) 檢測法。其中抗原捕獲ELISA方法已有商品化的試劑盒可供使用，但是在病毒培養過程中， 收獲的半成品或成品中同時存在活的豬瘟兔化弱毒、因各種外界因素失活的豬瘟兔化弱毒 以及在病毒培養中細胞產生的豬瘟結構蛋白抗原等均能與ELISA包被抗原反應，因此該方 法測出的數據大于實際的病毒含量，并未得到公眾的認可;RT-PCR和Real-Time PCR法是通 過檢測病毒核酸來對病毒進行定量，在半成品和成品的檢驗中不能區分是活的豬瘟兔化弱 毒還是失活的豬瘟兔化弱毒，因此在實際中也未廣泛使用;免疫熒光定量方法是使用熒光 抗體測定感染豬瘟兔化弱毒疫苗的細胞，通過測算不同稀釋度出現的熒光的細胞孔數計算 病毒含量，該方法的具體實施方法和細節如專利〇吧01310663187.9(公開日2014.03.05)所 述;此外，類似的使用酶標抗體代替熒光抗體對豬瘟病毒進行定量的方法也有報道，該方法 見專利0呢01010237929.8(公開日2010.12.15)。以上兩種方法均需要使用顯微鏡觀察，在 使用熒光抗體或酶標抗體時由于染色時間的差異等，特別是在檢測樣品量大時，容易造成 誤判，從而定量不準確，同時需要檢測人員具有豐富的經驗，否則容易因人為因素而形成誤 判。綜上所述，以上方法均具有很多的不足之處，亟需更簡便、快速的方法以提高檢測精度， 提高生產效率。
[0005] 有鑒于此，特提出本發明。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種豬瘟兔化弱毒疫苗病毒效力測定方法，所述方法可解 決現有技術測定成本高、測定時間長、測定精度差的問題。
[0007] 為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：
[0008] -種豬瘟兔化弱毒疫苗病毒效力測定方法，包括：
[0009] 1)、將待測豬瘟兔化弱毒疫苗樣品用DMEM培養液梯度稀釋后將各濃度樣品分別接 種到預先培養好的敏感細胞中，同時設置加入DMEM培養液的陰性對照及已知病毒效力的豬 瘟兔化弱毒疫苗作為陽性對照;加入各濃度樣品及對照樣品后進行病毒培養；
[0010] 2)、病毒培養完成后去掉細胞培養液，加入固定液進行固定，隨后依次加入抗體及 TMB顯色液;每次換液前均去掉上一次所用溶液并用清洗；
[0011] 3)、加入終止液終止反應;酶標儀讀取450nm吸光值并計算病毒效力。
[0012]本申請提供的測定方法使用細胞ELISA方法的原理進行豬瘟病毒的測定，操作簡 單、耗時短、精度高，可大幅提高生產效率，是一種值得推廣的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒效力 測定方法。
[0013] 其中，在步驟2)中，清洗所用的溶液為含有0.05%Tween-20的1 X磷酸鹽緩沖液。
[0014] 優選的，如上所述的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒效力測定方法，在步驟1)中，所述敏感 細胞為豬睪丸細胞、豬腎細胞的原代細胞或傳代細胞或兔腎細胞的原代細胞或傳代細胞中 的一種。
[0015] 優選的，如上所述的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒效力測定方法，在步驟1)中，所述敏感 細胞培養于細胞培養板中；接種于所述細胞培養板時的細胞匯合度為90%以上，接種的密 度為4~6X10 5個/mL。
[0016] 細胞匯合度是用來衡量細胞在培養皿中的總的生長情況的一個指標，指兩兩連接 在一起的克隆數目占總的比率;接種密度不宜過小，否則細胞不能很好的生長，也不宜過 大，否則細胞會堆積起來，從而降低病毒接種的陽性率。
[0017] 其中，細胞培養板的孔數可根據實驗中稀釋的梯度數量及每個樣所做的副孔數量 進行調整，常用48、96、384孔。
[0018] 通常細胞培養板每個孔的容積為300μ1左右，因而在以上述細胞密度進行接種時， 一般每個孔接種?〇〇μ1。
[0019] 進一步優選的，如上所述的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒效力測定方法，所述敏感細胞 培養于細胞培養板中的培養條件為：
[0020] 在36~38°C，4.5~5.5%C〇2的培養環境中培養12~24小時。
[0021] 優選的，如上所述的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒效力測定方法，在步驟1)中，所述梯度 稀釋的具體操作包括：
[0022]使用DMEM培養液作為稀釋液，以6~20個濃度梯度進行逐步稀釋，每個濃度梯度的 稀釋倍數均為2~15倍。
[0023] 濃度梯度的數量是根據細胞密度及初始病毒含量(估計值)進行確定的；稀釋倍數 過大則每次稀釋的誤差會增大，因而最大稀釋倍數限定在15倍。
[0024] 優選的，如上所述的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒效力測定方法，在步驟1)中，所述病毒 培養條件為：
[0025] 在36~38°C，4.5~5.5%C〇2的培養環境中培養48~96小時。
[0026] 優選的，如上所述的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒效力測定方法，在步驟2)中，所述固定 液為甲醇和丙酮1:1配制固定液;固定的條件和時間為:2~8°C靜置30~60min。
[0027] 甲醇丙酮固定液配置時候按照體積比1:1進行配置，加入固定液處理可以防止細 胞發生自溶并保存細胞固有物質，使細胞基本上保持與生活時的物質一致。固定時間不宜 過短也不宜過長，時間過短固定不完全，將降低抗原的反應靈敏度，造成假陰性結果；固定 時間過長會造成細胞脫造成假陽性結果。
[0028] 優選的，如上所述的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒效力測定方法，在步驟2)中，所述抗體 為HRP標記的抗豬瘟病毒抗體；
[0029] 或抗豬瘟病毒抗體及與其種屬來源相對應的HRP標記的二抗。
[0030] 進一步優選的，如上所述的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒效力測定方法，所述抗豬瘟病 毒抗體為兔源、豬源、小鼠源或大鼠源的抗豬瘟病毒單克隆抗體或多克隆抗體。
[0031] 優選的，如上所述的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒效力測定方法，在步驟3)中，所述分析 的方法為：
[0032] 用Reed-Muench法計算陽性結果的TCID50;
[0033] 所述陽性結果為：當陽性對照孔平均值0D450 2 1.0、陰性對照孔0D450〈0.1、測定 孔0D450nm>2.1倍陰性對照孔平均值時的實驗結果。
[0034]具體計算方法為：
[0035] LogTCID5Q =高于50%陽性孔率最高稀釋度的對數+距離比
[0036] 距離比=(高于50%陽性孔百分數-50% )八高于50%陽性孔率的百分數-低于 50%陽性孔率的百分數）。
[0037] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0038] 1)、與使用動物測定豬瘟病毒含量相比較，避免了因動物品種以及健康狀況等個 體差異所造成的影響，節約了測定成本，縮短了測定時間，且提高了測定精度。
[0039] 2)、與熒光定量PCR方法和抗原捕獲ELISA方法相比較，該方法間接測定繁殖后代 的病毒粒子，避免了因各種外界因素致死的病毒粒子的干擾，提高了測量精度。
[0040] 3)、與間接或直接免疫熒光技術相比較，可以避免因熒光抗體信號衰減或樣品量 大時人為觀測誤差所致的測量誤差。
【具體實施方式】
[0041] 下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為 可以通過市售購買獲得的常規產品。
[0042] 實施例1
[0043] S11、材料與試劑
[0044]陽性對照病毒:豬瘟兔化弱毒疫苗株購于中國獸醫藥品監察所，由四川華神獸用 生物制品有限公司畜禽生物制品四川省重點實驗室繁殖分裝保存備用（效價大于 106TCID5〇/ml)；
[0045] 測試樣品：豬瘟疫苗半成品20151209批次3收和4收樣品由四川華神獸用生物制品 有限公司畜禽生物制品四川省重點實驗室制備提供；
[0046] 細胞系豬睪丸細胞(ST)，按照《獸藥典》規程檢測不含外源病毒、細菌、霉菌和支原 體等污染物；
[0047] 細胞培養液DMEM購于Thermo Fisher Scientific;細胞傳代培養液含10%的豬瘟 專用血清，維持液含1 %的豬瘟專用血清；
[0048] 血清:豬瘟專用血清購于呼和浩特草原綠野生物工程材料有限公司；
[0049] 固定液:丙酮與甲醇比例為1:1配置；
[0050] 抗體:兔源豬瘟多克隆抗體為實驗室自制;HRP標記的羊抗兔二抗購于南京金斯瑞 生物科技有限公司；
[0051] 磷酸鹽緩沖液(PBS):NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HP〇4 · 12H2〇3.48g、KH2P〇4 0.2g，加 蒸餾水至l〇〇〇mL，分裝，121°C滅菌30min，備用；
[0052] Η)ΤΑ-胰酶溶液：0.25%的胰酶，5mM EDTA的PBS，pH 7·2-7·4。
[0053] 洗滌液PBST:向1000mL的PBS中加入0.5ml的Tween-20,混勻備用；
[0054] TMB(3，3'，5，5' -Tetramethylbenzidine)顯色液：單組分購于生工生物工程（上 海)股份有限公司；
[0055] 終止液:2M H2S〇4;蒸餾水178.3mL中逐滴加入98%的濃硫酸21.7mL配置而成；
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