體外用細胞代謝輪廓篩選馬兜鈴酸致腎毒性標志物的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分析化學和醫藥化學領域，還涉及代謝組學，特別是基于液相色譜質 譜聯用技術的代謝組學；具體的說是一種在體外利用細胞代謝輪廓篩選馬兜鈴酸致腎毒性 標志物的方法。
【背景技術】
[0002] 馬兜鈴酸（AA)是存在于馬兜鈴屬植物中的一種重要化學成分，含有馬兜鈴酸的 中藥主要用于治療關節炎、痛風、風濕病以及潰膿創傷。然而，近10年來，由于服用廣防己 (馬兜鈴屬）引起嚴重腎毒性的案例達100多例。研究表明，馬兜鈴酸是引發腎毒性的主要 因素，其機理主要是馬兜鈴酸與體內的DNA形成加合物，誘導A: T基因的突變。基因突變勢 必會引起下游相關代謝物的變化。目前臨床上還沒有統一的診斷標準，組織切片，AA-DNA加 合物的檢測是通常使用的診斷方法。開發新的診斷和預測腎損傷程度的標志物勢在必行。
[0003] 代謝組學作為系統生物學的最下游，能夠更準確的反應生物體系的狀態。在代謝 組學分析的各種手段中，液相色譜質譜聯用技術以其高分離度、高通量以及普適性的優勢， 在眾多分析方法中脫穎而出，尤其對于非靶向代謝組學分析，其強大的定性分析能力被認 為是最好的復雜生物樣品的分析技術之一。代謝組學在藥物安全性評價，毒性標志物識別 方面具有廣闊的應用前景.研究模型主要是動物模型，例如，Aiming Liu等應用小鼠模型 分析了降脂藥二甲苯庚酸誘發肝毒性的潛在標志物。Jing Ma應用小型豬模型發現了半乳 糖胺誘導急性肝損傷的生物標志物。然而，應用代謝組學方法研究體外細胞損傷模型中代 謝物差異的報道卻相對較少。
[0004] 細胞模型與動物模型相比，具有成本低、種屬差異小臨床轉化相對簡單等優點。申 請者應用人源化腎細胞研究了馬兜鈴酸致腎損傷進展過程中的差異代謝物。由于生物樣 品的復雜性，儀器本身存在的不穩定性及分析序列過長導致質譜響應產生一定的偏差，都 會為后續的數據建模帶來困難。針對以上情況，我們采用總蛋白校正，樣本概率商歸一化 (PQN)及質量控制樣本（QC)校正實驗偏差，以保證實驗數據的可靠性。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于建立一種基于超高效液相色譜質譜聯用技術利用體外細胞模 型篩選馬兜鈴酸致腎毒性潛在標志物的方法，該方法具有高靈敏度、高通量的優點。所篩選 的潛在標志物預測性好，可以為中藥致腎毒性的臨床診斷提供參考。
[0006] -種從胞內代謝輪廓篩選腎毒性發生發展過程中潛在標志物的方法，應用代謝組 學方法研究體外細胞損傷模型中代謝物差異，
[0007] 具體步驟如下：
[0008] (1)確定馬兜鈴酸致腎細胞明顯損傷的有效劑量；
[0009] (2)對正常腎細胞、馬兜鈴酸藥物損傷腎細胞的胞內代謝物進行分析得到胞內代 謝輪廓；
[0010] (3)應用多變量統計方法分析正常細胞和馬兜鈴酸藥物損傷細胞的代謝輪廓數 據，結合代謝物隨藥物作用時間的變化規律，篩選標志物。
[0011] 步驟（1)使用3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT)染色法確 定馬兜鈴酸致腎細胞明顯損傷的有效劑量，細胞明顯損傷指同等培養條件下馬兜鈴酸誘導 損傷實驗組細胞數目與正常組細胞數目相比，具有顯著性差異，P〈〇. 5,能夠導致這種明顯 損傷的馬兜鈴酸劑量即為馬兜鈴酸致腎細胞明顯損傷的有效劑量，采用人源化正常腎細胞 HL7702作為體外研究馬兜鈴酸致腎毒標志物的模型，建立了馬兜鈴酸致腎細胞明顯損傷的 有效劑量的確定方法：
[0012] 將懸浮于K-SFM細胞培養基中HK-2細胞等量接種于96孔板中（104-105個/ 孔）。過夜貼壁后，去掉原有培養基，實驗組分別加入150ul-250ul 0. 3125, 0. 625, 1. 25, 2 .5, 5, 10, 20, 40, 80 μ g/ml濃度的馬兜鈴酸，馬兜鈴酸水溶液采用K-SFM細胞培養基進行稀 釋。每個劑量設計3-6個平行孔，平行設置不加藥，只加等體積培養基的細胞控制組（對照 組）和不接種細胞，只加等體積培養基的空白組。培養24h-48h后，加入15-20ul含5mg/ ml MTT的磷酸緩沖溶液（pH = 7. 0)，避光培養3-5h，棄去培養液，加150ul-200ulDMS0,震 蕩300-500S，靜止10-30s，酶標儀檢測496-570nm波長下的吸光度（0D)。細胞抑制率按照 以下公式計算得出：
[0013] 抑制率=(控制組吸光度-給藥組吸光度V(控制組吸光度-空白組吸光 度）X100%
[0014] 對各組數據進行雙尾T檢驗，P值小于0. 05認為是馬兜鈴酸致腎細胞明顯損傷的 有效劑量，實驗中得到的有效劑量為大于20 μ g/ml。
[0015] 步驟（2)所述正常腎細胞為人源化正常腎細胞HL7702 ;所述馬兜鈴酸藥物損傷腎 細胞為采用兜鈴酸致腎細胞明顯損傷的有效劑量誘導損傷的人源化正常腎細胞HL7702,損 傷作用時間為6-24h;步驟（2)使用超高效液相色譜-質譜聯用技術對胞內代謝物進行分 析。
[0016] 建立了一套細胞樣本采集和處理的規范化流程。所有細胞樣本的采集步驟是相 同的，最大程度減少在樣品采集階段引入的人為誤差。該流程的具體步驟為：細胞刮刮取 正常組細胞，藥物作用24h以及中間兩個時間點的（nX4)個細胞樣品（約10-100mg)分 別置于1. 5ml離心管中，1000-1200rpm離心5分鐘得細胞餅即為所需細胞樣品；細胞樣品 重懸于1-1. 5ml甲醇/水（體積比4:1)溶液，用超聲細胞破碎儀冰上裂解細胞，裂解功 率：15% -25%，超聲時間：5-8s，間隔時間8-10s，總超聲時間：3-5min。得到的細胞裂解液 0- 4°C、12000-15000rpm離心10-15分鐘，上清液凍干復溶于100-300ul體積的水/甲醇v/ v為1/4-1/2的溶液中。得nX4個樣本。其中η為每組平行試驗的數量，為大于或等于6 的正整數；對ηΧ4個樣本一次進行超高效液相色譜-質譜聯用技術分析，條件如下：
[0017] 液相條件為：色譜柱為Agilent Eclipse plus C18柱，柱溫40-60°C，進樣量 1- 10 μ L，流動相A為體積濃度0. 1 % -0. 2 %的甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫條件： 0-3min，5% B相線性變化到50%，3-15min，線性變化到100% B相并保持5min，再切換到 5% B相并保持5min ;流速0. 3ml/min，柱后流出液不經分流直接導入質譜系統檢測；
[0018] 質譜條件為：電噴霧離子源（ESI)，采用正離子模式檢測；噴霧器流量為8-10L/ min，噴霧氣溫度為300-350°C，毛細管電壓為3500-4000V，進樣錐電壓為30-40V ;采集數據 的頻率為每秒一張譜圖；質量采集范圍m/z 100-1000,獲得被分析樣本的總離子流圖；最 終得到nX4個樣本的總離子流圖，即為腎細胞內代謝輪廓譜。
[0019] 同時，為了確保數據的可靠性，于nX4個樣本中隨機抽取一個樣品或兩個以上樣 品的混合物為質量控制樣本（QC)，作為質譜檢測過程中的質量控制標準，在對ηX 4樣品依 次進行質譜分析過程中，先將QC樣進樣3-5次穩定系統，然后每分析6-10個樣本，再將QC 樣進樣一次，通過分析QC樣總離子流圖，監控實驗過程中的系統偏差；另外，取細胞裂解液 10-20 μ L，采用蛋白定量試劑盒進行總蛋白定量，給藥組與對照組樣品的蛋白總量相除得 出總蛋白差異系數，給藥組各色譜峰面積除以此系數將給藥組細胞數目校正到對照組的細 胞數目，即可校正由于細胞數目的微小差異所造成的代謝譜強度的差異。
[0020] 步驟（3)所述多變量統計方法為偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA)方法；具體步 驟為：采用R語言對ηΧ4個樣本的胞內代謝輪廓譜進行峰提取，峰匹配，生成一個數據矩 陣，具體程序代碼如下：
[0021] setwd(^F:/experiment/software/R^)
[0022] source ("d2mzXML. r")
[0023] d2mzXML ("vl/"，"v2/")
[0024] path〈_system. file ("v2/"，package = 〃R/")
[0025] list, files (path, recursive = TRUE)
[0026] library (xcms)
[0027] xset〈_xcmsSet ("v2/"，method = 〃centWave"，ppm = 20, peakwidth = c (5, 20))
[0028] xset<-group (xset, bw = 15, minfrac = 0. 5, minsamp = 1, mzwid = 0. 25, max = 50, sleep = 0)
[0029] xset2〈_retcor(xset, family = "symmetric", plottype = "mdevden")
[0030] xset2<-group (xset2, bw = 10, minfrac = 0. 5, minsamp = 1, mzwi