氧化石墨烯熒光傳感器、制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于熒光傳感器技術領域，具體涉及石墨烯熒光傳感器的制備和在615nm 激光激發下對雙鏈DNA進行檢測的方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，簡單靈敏的熒光檢測技術在一些疾病的檢測中越來越起到重要作用。作 為攜帶眾多遺傳信息的DNA，由于各種外界原因的誘導而產生突變并有可能導致細胞癌變， 因此對于DNA的特異性識別和定量分析對于癌癥的早期診斷非常必要。在眾多DNA檢測方法 中，熒光探針技術由于其高靈敏、快速響應和簡單方便的特點，吸引了研究者的廣泛關注。
[0003] 目前，熒光傳感器淬滅劑材料主要可以分為三類：（1)貴金屬納米顆粒，如：納米 金、納米銀等，它們具有較高的熒光淬滅效率和較小的尺寸，但是該類熒光傳感器的制備成 本比較高。（2)聚合物納米材料，如:懸掛型聚合物、介孔納米材料聚合物、共輒聚合物和薄 膜聚合物，它們具有較高的選擇性和靈敏度，不過該類材料大多運用于一些金屬離子的檢 測。（3)碳納米材料，如:氧化石墨烯和碳納米管，該類熒光傳感器的制備成本較低，而且具 有比較高的熒光淬滅效率。并且氧化石墨烯表面含有大量的含氧官能團，可以使其很容易 的分散在各種溶劑中。
[0004]在已報道的氧化石墨烯熒光傳感器中，熒光基團絕大部分是采用非共價鍵的形式 與石墨烯作用，石墨烯與熒光材料之間的作用力比較弱。在檢測過程中，探針未遇到被測物 質就可能產生熒光基團的脫吸附現象，使得熒光恢復。導致探針的特異性能力較低且不可 以重復利用。也有一些研究者已經采用共價鍵的形式與氧化石墨烯結合制備出氧化石墨烯 熒光傳感器，但是他們一般采用價格比較昂貴的PEG、多肽或單鏈DNA為連接劑，增加了探針 的制備成本，限制了其應用范圍。在檢測DNA時，也大多采用以熒光標記單鏈DNA分子，去檢 測互補鏈，實現單鏈DNA的檢測。
[0005] 對于雙鏈DNA的檢測，目前主要采用的是破壞互補鏈，使得釋放出的熒光標記DNA 鏈被吸附到氧化石墨烯上，熒光被淬滅。
【發明內容】
[0006] 為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種構思不同的氧化石墨熒光 傳感器、制備方法及其應用，該傳感器在水溶液中可實現對雙鏈DNA的檢測。
[0007] 本發明中，采用有機胺作為連接劑，通過共價鍵實現了熒光染料分子與氧化石墨 烯的嫁接。該氧化石墨烯復合材料在水溶液或復雜的體系中具有對雙鏈的DNA(例如:鮭魚 精子StDNA)可特異性識別的能力。在DNA未加入前，熒光分子處于熒光猝滅狀態；加入DNA 后，DNA與熒光分子相互作用，產生較強的熒光發射信號。
[0008] -、氧化石墨烯熒光傳感器的制備方法
[0009] 本發明所涉及的石墨烯熒光傳感器，其結構通式如下：
[0010]
[0011 ] 式中：R為氧化石墨烯GO或二次氧化石墨烯sGO，6 < η < 12，a、b為自然數。
[0012] 本發明提供一種氧化石墨烯熒光傳感器，其結構通式如下：
[0013] 本發明還提供上述氧化石墨烯熒光傳感器的制備方法，具體步驟如下：
[0014] (1)氧化石墨烯材料的氨基化反應
[0015] ①將氧化石墨烯材料均勻分散在無水DMF中，然后在冰水浴下加入1-(3-二甲氨基 丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，進行羧基的活化處理，培育10-30min;其中：氧化石墨烯材 料和1-(3-二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽的質量比為2:0.95-2:1.1;氧化石墨稀 材料是氧化石墨烯或二次氧化石墨烯；
[0016] ②向培育后的氧化石墨烯材料中，加入NH2- (CH2)n-NH2，6 < η < 12，以及4-二甲氨 基吡啶，在30-50°C溫度下反應；
[0017]③反應結束后，用去離子水，抽濾洗滌除去其他物質，透析2-3天后濃縮冷凍干燥， 得到氨基化的氧化石墨烯材料；
[0018] (2)氨基化的氧化石墨烯材料的叔胺化
[0019]①氨基化的氧化石墨烯材料于乙酸中分散；
[0020] ②加入37wt%甲醛水溶液和乙酸鋅，超聲分散，并在25-35Γ溫度下反應2-5小時； 其中：氨基化的氧化石墨烯材料和乙酸鋅的質量比為1:0.95-1:1.1;
[0021] ③反應結束后，用去離子水，抽濾洗滌，透析，濃縮后冷凍干燥，得到叔胺化的氧化 石墨稀材料；
[0022] (3)氧化石墨烯熒光傳感器的制備
[0023] ①將叔胺化的氧化石墨烯材料于無水DMF中超聲攪拌，使其分散均勻。
[0024] ②向步驟①得到的溶液中，加入噻唑橙熒光染料T03-I和κ2ω3,惰性氣氛保護下 50-65°C溫度下右反應30-60小時；
[0025] ③反應結束后，用去離子水沖洗，透析，濃縮后冷凍干燥，得到氧化石墨烯熒光傳 感器。
[0026]上述步驟(3)中，叔胺化的氧化石墨烯材料和噻唑橙熒光染料T03-I的質量比為1: 1-1:10〇
[0027]進一步的，本發明提供上述氧化石墨烯熒光傳感器在雙鏈DNA檢測領域的應用。優 選的，所述雙鏈DNA包括鮭魚精子StDNA、鯡魚精子DNA和小牛胸腺DNA。
[0028] 本發明的有益效果在于：本發明的石墨烯熒光傳感器其和現有的傳感器構思不 同，該氧化石墨烯復合材料在水溶液或復雜的體系中具有對雙鏈的DNA(例如：鮭魚精子 S tDNA、鯡魚精子DNA和小牛胸腺DNA等）可特異性識別的能力。同時可通過調整熒光分子與 石墨烯之間的距離或者反應比例，以及改變氧化石墨烯的種類制備出不同熒光效果的傳感 器。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發明傳感器設計原理圖；其中a為氧化石墨烯平臺；b為氧化石墨烯熒光傳 感器復合材料;c為加入雙鏈DNA后的氧化石墨烯熒光傳感器復合材料作用機理。
[0030] 圖2為實施例5加入不同濃度的StDNA后G0NT12-T03的熒光發射光譜。
[0031]圖3為實施例6加入不同濃度的StDNA后SG0NT12-T03的熒光發射光譜。
[0032]圖4為實施例7中G0NT12-T03在相同濃度下的不同生物小分子的選擇性實驗。（1: 去離子水，2: StDNA，3:半胱氨酸，4:脯氨酸，5:精氨酸，6:谷胱甘肽，7:葡萄糖，8:蔗糖）
【具體實施方式】
[0033]實施例1熒光染料分子的合成
[0034]
[0035] (1)4-二甲基喹啉碘鹽的合成
[0036] 將4-甲基喹啉（2.198，15.3111111〇1)加入到裝有4〇1^甲苯的10〇1^的圓底燒瓶中，然 后加入碘甲烷(2.30g，16. lOmmo 1)。用油浴鍋把混合物加熱到80°C左右，反應6-8小時，觀察 有大量的黃色沉淀析出。抽濾收集固體，用甲苯洗滌三次，在真空冷凍干燥器中干燥24小 時，得到黃色固體(3.88g, 13.60mmol)。
[0037] (2)化合物(Z/E)-l_甲基-4-(2-(苯基氨基）乙烯基)喹啉碘鹽的合成
[0038] 將Ν,Ν-二苯甲脒（0.6888,3.52111111〇1)和1，4-二甲基喹啉碘鹽（1.(^，3.52111111〇1)放 到研缽中充分研磨，使它們充分混合。然后將混合均勻的粉末轉移到100mL燒瓶中，在氬氣 保護下160°C反應30分鐘，有黑色焦油狀物質生成。冷卻到室溫，用80mL二氯甲烷/甲醇（1: 1)混合溶劑溶解，濃縮到約6_7mL有紫黑色固體析出，然后用甲醇洗滌兩次，得到紫色固體 (1·0g，2·58mmol)。
[0039] (3)BSN-I 的合成
[0040] 2-甲基苯并噻唑（1 .0g，6.71mmol)和1，2_二（2-碘乙氧基）乙烷（10.0g， 27.03mmol)加入到100mL圓底燒瓶。對反應體系進行氬氣保護，然后將混合物加熱到110°C 左右，反應24小時，有白綠色的固體產生。然后冷卻至室溫，使用80mL的二氯甲烷/石油醚 (3:1)混合溶劑將粗產物洗滌3次，抽濾收集固體，真空冷凍干燥，最終得到白色固體 (0.65g,1.25mmol)〇
[0041] (4)T03-I 的合成
[0042] 8311(0.38,0.578111111〇1)，（2/^)-1-甲基-4-(2-(苯基氨基）乙烯基）喹啉碘鹽 (0.1978,0.525臟〇1)和醋酸鉀（51.511^，0.525臟〇1)加入到501^圓底燒瓶中，然后向其中加 入15mL醋酸酐。對反應體系進行氬氣保護，將混合物加熱到70°C左右，反應30分鐘。然后用 旋蒸除去溶劑，用硅膠柱層析，甲醇/二氯（0-2%)做流動相洗脫。最終得到藍色固體 (0.13g,0.19mmo1)。
[0043] 實施例2氧化石墨烯(GO)的制備
[0044] (1)量取25mL濃硫酸加入100mL燒瓶中，加熱至90°C，然后依次緩慢加入5g過硫酸 鉀和5g五氧化二磷。當溫度降至80°C時，加入5g石墨粉，反應4到5小時。然后加入1L的去離 子水稀釋并放置過夜。
[0045] (2)用2L蒸餾水將上面的預氧化石墨進行抽慮洗滌，去除大部分酸，然后將得到的 石墨粉末置于50°C干燥過夜。
[0046] (3)取230mL濃硫酸置于1L的燒瓶中，用冰浴冷卻20min，然后依次緩慢加入上面處 理過的預氧化石墨和30g高錳酸鉀，并大力攪拌20min，接著將反應體系置于35°C水浴中反 應2小時，然后往反應體系中緩慢加入460mL蒸餾水，直至當最后一滴蒸餾水加入時，不再引 起明顯的溫度變化，然后再加入1.4L的去離子水稀釋，緩慢攪拌，反應2個小時后，加入25mL 30 %的過氧化氫水溶液，此時溶液顏色變成土黃色。最后用5 %的稀鹽酸洗滌3次，2L去離子 水洗滌2次，離心得到較濃的氧化石墨溶液。
[0047] (4)用去離子水稀釋所得到的氧化石墨，然后超聲剝離，直至成透明的棕色懸浮 液，得到氧化石墨稀。
[0048]實施例3二次氧化石墨烯的制備
[0049] (1)量取25mL的濃硫酸加入到1 OOmL的反應瓶中，緩慢的加入1 g氧化石墨稀，并攪 拌使其均勻分散在濃硫酸中，在室溫下加入5g的高錳酸鉀，攪拌20分鐘。
[0050] (2)等反應結束后，用200mL濃鹽酸抽洗三次，然后用2L蒸餾水將上面的殘余的高 錳酸鉀和酸抽濾洗滌，以達到中和的效果。
[0051] (3)將抽濾中和的產物在超聲下溶入100mL的蒸餾水中，透析4-5天。然后旋去溶 劑，冷凍干燥得到二次氧化石墨稀(sGO)。
[0052]實施例4氧化石墨烯熒光傳感器的DNA檢測方法 [0053] (l)DNA溶