諾如病毒的逆轉錄環介導等溫擴增檢測引物組、檢測方法和試劑盒的制作方法
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種諾如病毒的逆轉錄環介導等溫擴增檢測 引物組、檢測方法和試劑盒。
【背景技術】：
[0002] 諾如病毒感染性腹瀉具有發病急、傳播速度快、涉及范圍廣等特點，是引起非細菌 性腹瀉暴發的主要病因。諾如病毒感染性強，以腸道傳播為主，可通過污染的水源、食物、物 品、空氣等傳播，常在社區、學校、餐館、醫院、托兒所、孤老院及軍隊等處引起集體暴發。不 同地區、不同時間流行的諾如病毒，其基因 RNA多聚酶區序列相對保守。根據RNA多聚酶區核 苷酸序列的相似性，諾如病毒被分為5個基因群(genogroup)。同一基因群內的諾如病毒，其 主要衣殼蛋白（major capsid protein)氨基酸序列的異質性約為30%，但不同基因群間的 諾如病毒，其主要衣殼蛋白（major capsid protein)氨基酸序列的異質性超過50%。目前 已知，感染人類的諾如病毒至少包括基因 I群、Π 群和IV群。諾如病毒對各種理化因素有較 強的抗性，已知其耐熱和耐凍，60 °C孵育30min仍有感染性，冷凍數年后仍保持活性;對乙醚 和酸穩定，20%乙醚4°C處理可存活18h，室溫pH2.7環境下可存活3h。諾如病毒對處理污水 的1 Oppm的氯濃度敏感，但對處理飲用水的3.7 5~6.25ppm的氯濃度耐受。此外，諾如病毒的 感染劑量很低，10-100個病毒粒子即可使人致病，而且諾如病毒常呈暴發流行，因此，即使 環境中存在的微量病毒，仍然對人得健康存在很大威脅。
[0003] 諾如病毒遺傳高度變異，在同一時期和同一社區內可能存在遺傳特性不同的毒株 流行。諾如病毒抗體沒有顯著的保護作用，尤其是沒有長期免疫保護作用，極易造成反復感 染。諾如病毒感染性腹瀉在全世界范圍內均有流行，全年均可發生感染，感染對象主要是成 人和學齡兒童，寒冷季節呈現高發。美國每年在所有的非細菌性腹瀉暴發中，60-90%是由 諾如病毒引起。荷蘭、英國、日本、澳大利亞等發達國家也都有類似結果。在發展中國家，諾 如病毒感染性腹瀉普遍存在，也常引起暴發流行。在我國5歲以下腹瀉兒童中，諾如病毒檢 出率為15%左右，血清抗體水平調查表明我國人群中諾如病毒的感染亦十分普遍。
[0004] 目前諾如病毒病原的檢測方法有電鏡技術、病毒分離培養技術、免疫學技術及分 子生物學技術，但上述的前三種技術往往存在靈敏度較低、操作繁瑣耗時、需要大型昂貴的 儀器設備等缺點，在應用時往往有其局限性，尤其不能適用于大規模的病原篩查和檢測等 實際應用。分子生物學技術，其中尤其以RT-PCR檢測技術由于其快速、靈敏、適合處理大通 量的樣品等特點，在病毒檢測中顯示出其優越性并越來越多的得以應用，但該方法從檢測 到結果的判讀仍然需要多種專用儀器，操作較為繁瑣，所需時間仍然在5小時以上，常有非 特異性出現等缺陷。LAMP方法是2000年Notomi等開發的一種新型核酸擴增技術，針對待測 靶基因的6個區域設計4-6條特異性引物，在BstDNA聚合酶的作用下，在65°C左右等溫條件 lh內可以進行特異高效快速的核酸擴增，達到109拷貝，擴增結果可直接觀察焦磷酸鎂沉淀 或者加入顯色劑進行判斷。近年來LAMP方法已廣泛用于細菌、病毒等致病微生物的檢測，并 在此基礎上發展了 RT-LAMP檢測方法，成功應用于多種RNA病毒的檢測。
【發明內容】
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[0005] 本發明的第一目的是提供一種應用逆轉錄環介導等溫擴增檢測諾如病毒 (norovirus)的檢測引物組，利用該檢測引物組可以特異性的檢測諾如病毒(norovirus)。
[0006] -種應用逆轉錄環介導等溫擴增檢測諾如病毒的檢測引物組，其特征在于，由下 列引物組成：
[0007] 上游外引物F3:5'-GATGGGTCCRCAGCCAAC-3'；（其序列如SEQIDN0.1所示）
[0008]下游外引物B3:5'-TCARATCAGGGCCYAAGG-3'；（其序列如SEQIDN0.2所示）
[0009] 上游內引物FIP: 5 ' -GCTACAGGYGCCGCRATAGCGGATCCCCCAGAGGTCAACAATGAGG-3 ' ； (其序列如SEQ ID NO.3所示）
[0010] 下游內引物BIP: 5 ' -TACAAGCCCCTGGTGGAGAGTCGATCCCGCGCTCCAYAGTATYTCAC-3'；（其序列如SEQ ID N0.4所示）
[0011] 所述的 R為 A/G，Y為 C/T。
[0012] 本發明的第二個目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的諾如病毒的檢測方 法，其特征在于，對樣品進行病毒RNA提取，得到RNA樣品，然后通過逆轉錄環介導等溫擴增 的方法用所述的檢測引物組對RNA樣品進行擴增，確認是否存在有擴增產物。
[0013] 優選，所述的樣品為醫院的腹瀉樣品，水或食品。
[0014] 優選，所述的通過逆轉錄環介導等溫擴增的方法用所述的檢測引物組對RNA樣品 進行擴增具體為:環介導等溫擴增體系為：1〇\131^€612.5以1^、1〇111]\1(1階？8 3以1^、1(^]\1?1? 2μL、10μΜ ΒΙΡ 0·5μL、10μΜ F3 0·5μL、10μΜ B3 2yL、25mM MgS〇4 2yL、0.4M Betaine 2·5μ L、Bst DNA聚合酶lyL、AMV逆轉錄酶0.25yL、RNAlyL，去離子水補足至25yL，反應條件為:64 °C 孵育 40min。
[0015] 優選，所述的確認是否存在有擴增產物是在終止反應的反應管中加入lyL 10% SYBR GreenI顯色劑，10min后觀察結果，如果顏色為黃色，則樣品諾如病毒陰性，無諾如病 毒，如果顏色為綠色，則樣品諾如病毒陽性，含有諾如病毒。
[0016] 本發明的第三個目的是提供一種諾如病毒的檢測試劑盒，包括RNA提取試劑，逆轉 錄環介導等溫擴增試劑和檢測引物組，其特征在于，所述的檢測引物組由下列引物組成：
[0017] 上游外引物F3:5 ' -GATGGGTCCRCAGCCAAC-3 ' ；
[0018] 下游外引物B3:5 ' -TCARATCAGGGCCYAAGG-3 ' ；
[0019] 上游內引物FIP: 5' -GCTACAGGYGCCGCRATAGCGGATCC(XCAGAGGTCAACAATGAGG-3' ；
[0020] 下游內引物BIP: 5 ' -TACAAGCCCCTGGTGGAGA(;TGGATCCCGCGCTCCAYAGTATYTCAC-3，；
[0021] 所述的 R為 A/G，Y為 C/T。
[0022]本發明建立了敏感高、特異高、簡便的RT-LAMP檢測NV病毒的方法，并且將簡并引 物引入其中以增強檢測的特異性。該方法只需一臺水浴鍋在一個小時內即可完成。而且，可 直接用肉眼觀察，使之便于在簡易實驗室用于病原診斷。該方法在野外實驗中，也顯示出很 高的靈敏性，能夠用于臨床試驗。
[0023] RT-LAMP比RT-PCR快約60min，敏感度高，有兩個實驗可以證明。一個是梯度稀釋 RNA模板來進行擴增；另一個是50個臨床樣品檢測。擴增引物的設計要考慮到RNA病毒基因 組容易變異這一點。本發明設計的簡并引物能夠特異地擴增NV，并不能擴增其他種病毒的 基因組。
[0024]總之，本發明建立的檢測NV的RT-LAMP技術簡便、特異、靈敏，適用于野外和簡易實 驗室檢測，提供了新的病毒檢測方法。設計了一套RT-LAMP簡并引物，建立了檢測NV的一步 法RT-LAMP技術，能簡便、特異、靈敏檢測尿囊液和組織樣品中的NV;并優化了反應溫度(64 °C )、反應時間（40min)等參數。在樣品檢測中，RT-LAMP技術的靈敏度達97.7 %，高于RT-PCR 的90.7%，更適用于野外樣品和簡陋實驗室的快捷檢測，可廣泛應用于醫院、食品行業、出 入境檢驗檢疫及質量監督等部門及領域。
【附圖說明】：
[0025] 圖1是不同反應溫度擴增的結果，其中M，DL2000 DNA Marker;65、64、63、62、61、 60、59分別代表65 °C、64°C、63 °C、62 °C、61°C、60 °C、59 °C，N，陰性對照；
[0026] 圖2是不同反應時間擴增的結果，其中M，DL2000 DNA Marker;60、50、40、30、20分 別為60min, 50min，40min, 30min，20min;N，陰性對照；
[0027] 圖3是不同Mg2+濃度擴增的結果，其中M，DL2000 DNA Marker;泳道1-4的MgS〇4濃度 分別為511^、411^、311^、211^時的1^^擴增結果4為陰性對照