一種噬菌體滅菌時化學抗菌劑篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫療衛生保健技術領域，具體涉及一種噬菌體滅菌時化學抗菌劑篩選 方法。
【背景技術】
[0002] 化學抗菌劑通常包括用于體外的消毒劑(如環境消毒和生物體表皮膚黏膜消毒） 和用于生物體內治療感染的天然抗生素或人工合成的抗菌藥物。在醫療衛生保健技術領 域，為快速、有效控病菌感染，常需大量使用各種類型的化學抗菌劑進行滅菌處理。然而，隨 著大量廣譜類抗菌劑的長期使用，細菌耐藥問題逐年加劇，一系列耐藥病原菌，如結核桿 菌、金萄菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、腸球菌和銅綠假單胞菌等病原菌耐 藥菌株的出現，引起公眾的廣泛關注，這也是人們意識到，尋找新的、更為環保和生態的抑 制病原菌的用藥方式是解決細菌耐藥問題根本出路。
[0003] 噬菌體是一種可以感染并裂解殺滅細菌的天然存在的病毒，最早由Twort和 Herelle D兩人分別于1915年和1917年發現。由于其對人和動物無害，因此可將殺菌能力強 的噬菌體用于自然環境和生物體內環境中的殺菌，以達到防治細菌感染體目的。由于噬菌 體滅菌方式的環保性、高效性、特異性，因而使得人們近年對于噬菌體滅菌技術重新產生了 濃厚的興趣。
[0004]在化學抗菌劑仍是控制細菌感染主流方法的背景下，采用噬菌體滅菌作為化學抗 菌劑的補充具有十分重要的意義。但實際應用過程中，由于噬菌體種類繁多（自然界中超過 1〇8種），化學抗菌劑的種類也很多，加之在應用噬菌體殺菌的環境中常常會有化學抗菌劑 的殘留，而噬菌體與化學抗菌劑殺菌機制又完全不同，因而在噬菌體與化學抗菌劑聯合使 用時，如何在種類繁多的噬菌體和化學抗菌劑中選擇出最佳的組合，是首先需要解決的關 鍵問題。
【發明內容】
[0005] 本發明目的是提供一種噬菌體滅菌時，篩選可以聯合使用的化學抗菌劑的方法， 從而為噬菌體與化學抗菌劑的聯合應用提供可靠保障。
[0006] 本發明所采取的詳細技術方案如下所述。
[0007] -種噬菌體滅菌時化學抗菌劑篩選方法，具體包括如下步驟： (1) 制備培養基，本發明中采用雙層固體培養基，具體為： 首先制備底層固體培養基，即加入1.5%的瓊脂粉的LB培養基，滅菌后，無菌環境下傾倒 于無菌的9cm平皿中（1 OmL/平皿），制成固體培養基，凝固后置4°C保存待用，使用前置37 °C 下預熱； 其次制備頂層用半固體培養基，即加入0.5%的瓊脂粉的LB培養基，將培養基融化后分 裝于玻璃試管中（3mL/管），加蓋滅菌后，趁熱置于45°C水浴中保溫以避免凝固； (2) 接種病菌和噬菌體，具體為，將lOOyL菌液(109 CFU/ml)和lOOyL噬菌體懸液分別加 入到步驟（1)中的半固體培養基中，混合均勻后，傾倒于步驟（1)中的固體培養基中，并鋪 勻，室溫(20~25°C)凝固； 需要解釋的是，噬菌體懸液濃度以前期的預實驗結果為準，對于噬菌體懸液濃度進行 控制主要是控制噬菌體在每個平皿中形成噬菌斑的數量，由于不同噬菌體所形成的噬菌斑 的大小不同，因此噬菌體數量(噬菌體懸液濃度)并不是固定的，但以不會構成融合的最大 噬菌斑數為最佳； (3)加入抗菌劑，在步驟(2)中凝固后的雙層培養基中滴加5tiL化學抗菌劑，培養約8~ 48h(培養時以所接種病菌的最適生長溫度為宜），觀察噬菌斑并進行判斷； 需要解釋的是，滴加化學抗菌劑后培養時間可根據不同細菌生長速度適當做調整，即 培養時間等于菌苔的透明度達到穩定所需的時間； 判斷時，可依據噬菌體成斑率、噬菌斑大小和形態變化、化學抗菌劑抑菌區透明度變化 等單獨或者聯合對化學抗菌劑與噬菌斑合用的滅菌效果進行判定； 依據噬菌體成斑率進行判斷時，觀察消毒劑作用區域噬菌體成斑率的變化，成斑率增 高即表明化學抗菌劑對噬菌體殺菌起促進作用，成斑率降低即表明化學抗菌劑對噬菌體殺 菌起抑制作用； 依據噬菌斑大小或形態變化進行判斷時，觀察消毒劑作用區域噬菌斑，如果噬菌斑明 顯增大，或向消毒劑抑菌圈方向局部增大而被"拉長"，表明化學抗菌劑對噬菌體滅菌起促 進作用；反之，觀察消毒劑作用區域噬菌斑，如果噬菌斑明顯減小，或向消毒劑抑菌圈方向 局部縮小而被"擠壓"，表明化學抗菌劑對噬菌體滅菌起抑制作用； 依據化學抗菌劑抑菌區透明度變化進行判斷時，觀察與噬菌斑相鄰處化學抗菌劑抑菌 區透明度的變化，如果與噬菌斑相鄰處化學抗菌劑抑菌區透明度增加，表明化學抗菌劑對 噬菌體滅菌起促進作用;反之，如果與噬菌斑相鄰處化學抗菌劑抑菌區透明度降低，表明化 學抗菌劑對噬菌體滅菌起抑制作用。
[0008] 實際應用過程中，滴加抗菌劑方式也可更改為粘貼具有特定濃度抗菌劑的紙片方 式進行實驗。
[0009] 在本發明中，接種的病菌具體例如:肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、 陰溝腸桿菌、大腸埃希菌等;采用的噬菌體為用這些病菌作為指示菌從環境中分離獲得的 特異性噬菌體。
[0010] 所述抗菌劑例如:84消毒液、雙氧水、苯扎溴銨、石碳酸、碘伏、戊二醛或臨床中所 用抗生素類藥劑等。
[0011] 現有技術中，針對特定病菌篩選針對性的噬菌體的技術已經較為成熟，而且由于 噬菌體滅菌的特異性和環保性，因而實際抗菌、治療過程中也有一定的應用試驗。但由于現 有技術中針對病菌的滅菌、抗菌時仍以化學抗菌劑為主，因而在噬菌體與化學抗菌劑聯用 時，其相互作用、相互影響如何尚缺乏較為系統的研究。
[0012] 本申請以部分特定菌株和噬菌體及部分廣譜性的抗菌劑為代表，對于噬菌體與化 學抗菌劑聯用時的相互作用、相互影響進行了初步探討，所提供的噬菌體滅菌時的化學抗 菌劑的篩選方法，為篩選獲得噬菌體與抗菌劑的最佳組合，以其獲得最佳抗菌效果提供了 較好的技術保障。
[0013] 總體而言，本發明所提供的化學抗菌劑的篩選方法，操作簡單、結果穩定、可信度 高，且容易觀察和判斷，因而在衛生保健領域具有較好地應用前景。
【附圖說明】
[0014] 圖1為未滴加抗菌劑時噬菌體所形成噬菌斑形態，其中A為噬菌體PL2在銅綠假單 胞菌L2菌苔上形成的噬菌斑，B為噬菌體PF8在肺炎克雷伯菌F8菌苔上形成的噬菌斑，C為噬 菌體PF2在肺炎克雷伯菌F2菌苔上形成的噬菌斑，D為噬菌體PA1在鮑曼不動桿菌A1菌苔上 形成的噬菌斑； 圖2為6種抗菌劑在頂層半固體培養基中對不同菌株的菌苔上形成抑菌區的形態(不含 有噬菌體），其中A為肺炎克雷伯菌F7，B為肺炎克雷伯菌F4，C為銅綠假單胞菌L3，D為鮑曼不 動桿菌A4，1、2、3、4、5、6代表的是6種不同抗菌劑的編號； 圖3為抗菌劑與噬菌體聯合使用時部分菌株上的噬菌體成斑率變化情況結果，其中左 圖的噬菌體為PF1，菌株為肺炎克雷伯菌F1;右圖的噬菌體為PF12,菌株為肺炎克雷伯菌 F12,白色箭頭所指的是4號抗菌劑(石炭酸）； 圖4為抗菌劑與噬菌體聯合使用時部分菌株上的噬菌體成斑率變化情況結果，其中菌 株為肺炎克雷伯菌F19,噬菌體為PF19,白色箭頭所指抗菌劑的周圍區域成斑率均明顯降 低； 圖5為抗菌劑與噬菌體聯合使用時部分菌株上的噬菌體成斑率變化情況結果，其中菌 株為肺炎克雷伯菌F6,噬菌體為PF18,白色箭頭所指抗菌劑的周圍區域成斑率均明顯降低； 圖6為抗菌劑與噬菌體聯合使用時部分菌株上的噬菌體成斑率變化情況結果，其中左 圖噬菌體為PA3，菌株為鮑曼不動桿菌A3;右圖噬菌體為PG7，菌株為陰溝腸桿菌G7;兩個黑 色箭頭所指抗菌劑的周圍區域成斑率均明顯增高； 圖7為抗菌劑與噬菌體聯合使用時部分菌株上的噬菌體成斑率變化情況結果，其中菌 株為肺炎克雷伯菌F13，噬菌體為PF13，黑色箭頭所指抗菌劑的周圍區域成斑率明顯增高； 圖8為抗菌劑與噬菌體聯合使用時，抗菌劑作用區域噬菌斑的大小和形態變化的部分 實驗結果，其中左圖的噬菌體為PL4，菌株為肺炎克雷伯菌L4;右圖的噬菌體為PL1，菌株為 肺炎克雷伯菌L1，灰色箭頭所指抗菌劑透明圓的周圍區域噬菌斑均明顯增大； 圖9為抗菌劑與噬菌體聯合使用時，抗菌劑作用區域噬菌斑的大小和形態變化的部分 實驗結果，其中左上圖的噬菌體為PA5