小鼠短串聯(lián)重復序列的復合擴增體系及檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及鑒定小鼠多個短串聯(lián)重復序列的復合擴增體系及 其試劑盒，可以快速準確進行小鼠細胞STR分型進而鑒定小鼠細胞系類型。
【背景技術】
[0002] 2009年，Nature上的一篇社論指出：在數(shù)以千計的使用細胞系的生物實驗室中，許 多實驗室并不知道，介于1/5-1/3之間的常用細胞系可能已不是原先認為的那樣了。過去的 25年里，大量的研究，加上美國、英國、德國和日本細胞庫的經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)：18-36%的培養(yǎng)物含 有錯誤鑒定的物種或其它細胞類型。
[0003] 2010年5月ATCC SD0(Standards Development Organization)工作組在Nature review cancer 雜志上發(fā)表了題為〈〈Cell line mi si dent if icat ion ： the beginning of the end》前瞻性報道。報道指出：細胞系作為正常或腫瘤組織的模式細胞被廣泛應用于科 學研究和藥物開發(fā)，然而很大一部分的細胞系被錯誤標記或被其它個體、組織、種系來源的 細胞所替代，由于科學界無法解決此類問題以致大量因使用錯誤鑒定的細胞系而導致誤導 或存在潛在錯誤的學術論文發(fā)表。
[0004] 目前許多方法已被用來檢測細胞系交叉污染，包括同工酶分析、核型分析、人類白 細胞抗原(HLA)分型，免疫分型和DNA指紋識別。這些方法都可以鑒別出某一種細胞系，但是 鑒別細胞交叉污染的能力各不相同。而且，這些方法在不同實驗室所得到的數(shù)據(jù)卻不盡相 同，以致沒有任何一種方法可以用來建立一個標準參考數(shù)據(jù)庫。
[0005] STR位點是生物物種基因組上存在的由不同數(shù)目重復單元組成的重復DNA序列，具 有高度多態(tài)性，是一種良好的物種內或物種間鑒別的標記。通過一個PCR反應，可同時擴增 出多個長短不一的STR片段，通過引物上標記的不同熒光基團，對不同的STR組別加以區(qū)分， 可形成具有個體特征的圖譜，進而可以對細胞進行鑒別。STR檢測最先應用于親緣鑒定、法 醫(yī)鑒定、以及鑒定在20年之前的大災難中遇難的受害者。隨后，STR分型用于細胞鑒定中。目 前，STR分型技術已被廣泛應用于人源細胞系的鑒定，并已建立起標準的STR Marker組合， 用于鑒定1000多種細胞。
[0006] 在過去一個世紀的研究中，小鼠已經(jīng)成為建立人類遺傳性疾病的動物模型的最佳 實驗材料，小鼠細胞系已廣泛應用于生命科學研究的各個領域。如3T3、小鼠骨髓瘤細胞、L-929、和CTLL-2等多種，是除了人類細胞外被應用數(shù)量最多的動物細胞，數(shù)量有幾百種。因 此，建立小鼠細胞系的STR分型方法，對于每一位使用小鼠細胞系的研究者來說無疑是一個 福音，也必將極大地促進人類健康事業(yè)的發(fā)展。
[0007] 在2011年，專利CN102559878B，率先建立了小鼠短串聯(lián)重復序列的復合擴增體系 及檢測試劑盒，包含7個STR位點和1個性別判定位點，打開STR小鼠細胞分型檢測的新篇章。 但該專利采用的STR位點均為2nt.重復，導致stutter峰高，不利于判斷小鼠細胞間交叉污 染;并且僅有小鼠 STR位點，無法對人、鼠細胞交叉污染做出判斷。
【發(fā)明內容】
[0008] 針對上述領域中的不足和需求，本發(fā)明提供一種鑒定小鼠細胞系的復合擴增體 系，其擴增的位點是一些可以用來鑒定小鼠細胞系的STR位點，在鑒定小鼠細胞系時，具有 快速、操作簡單、結果準確、便于大規(guī)模推廣等優(yōu)點，這種方法隨著試劑盒開發(fā)成功可以批 量生產(chǎn)，使用條件可以模式化，全部過程都有自動化設備，不再依賴于人的操作經(jīng)驗，可以 實現(xiàn)自動化，所需時間短，整個檢測時間需要6小時左右。
[0009] 小鼠短串聯(lián)重復序列的復合擴增體系，所述擴增體系中同時擴增小鼠 STlUtgM-1、M-2、M-3、M-4、M-5、M-6、M-7、M-8和M-9，其序列分別如SEQIDN0:1、SEQIDN0:1、SEQID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、 SEQ ID NO: 11所述。
[00?0]所述擴增體系中還包括性另Ij判定位點Jaridl。
[0011] 所述擴增體系中還包括人源STR位點CSF1P0和vWA。
[0012] 所述引物分別為：
[0013] 擴增M-ι的引物：
[0014] 引物1: TCACAGGTATTTTCTAGATGGTTCCA，
[0015] 引物2: CAGCCTTAGAGTCAATCACCAGGT;
[0016] 擴增M-2的引物：
[0017] 引物1: TTTGAGGACAGTCTGTTTCAAA，
[0018] 引物2: CAGACATTCCTGAGTTGTGG;
[0019] 擴增M-3的引物：
[0020] 引物 1: CAGCCAGTGGAGAAGAGGGAGC，
[0021 ]引物2: AAACTAAGGGGCCAGTAAGATGG;
[0022] 擴增M-4的引物：
[0023] 引物 1: TGGCTTTGAAAGAAATCCTTGATG，
[0024] 引物2: GGGGAGGGTGTCCCAGACTCCA;
[0025] 擴增M-5的引物：
[0026] 引物 1 :gccaagatatgcaaagaacaaaaa，
[0027] 引物2: AGATGGCATTATCATATTCATGA;
[0028] 擴增M-6的引物：
[0029] 引物 1: ATAAATAAGGTAGGAGATTAGAT，
[0030] 引物2: ACTTGACATGCTTCTCAGGGAGG;
[0031] 擴增M-7的引物：
[0032] 引物1: TCTATACTTACATGTAACAGGT，
[0033] 引物2: AAAGATTATTTTATAGTGATGGACTTAT;
[0034] 擴增M-8的引物：
[0035] 引物 1: AGCACCAAGGTTCAACTAAGAATA，
[0036] 引物2: ACTACTTCACTATAAGTAGGTAG;
[0037] 擴增M-9的引物：
[0038] 引物1: AGCCATGGCAGGACAGGTGGTG，
[0039] 引物2: TTTAATTTTTCTTGTAACCCACA。
[0040] 擴增Jaridl的引物：
[0041 ]引物1 :GCTGACTACTTCAACATGC，
[0042] 引物2: CCGCTGCCAAATTCTTTGG。
[0043] 擴增CSF1P0的引物：
[0044] 引物1: TCTTAACCTATTGGGAGGTCATTGT，
[0045] 引物2: AGCCTTCTCAGATACTATCTCCTGG;
[0046] 擴增vWA的引物：
[0047] 引物 1: CAAGTTGACTTGGCTGAGATGTG，
[0048] 引物2 :GGATGGATAGATGGATAGATAGATA〇
[0049] 所述擴增體系中的被擴增位點，分別由三種分別在每一對引物的其中一條引物的 5 '末端帶有不同顏色的熒光標記物，三組組合分別為:第一組:M-1、M-2、M-3、M-4和M-5;第 二組:M-6、M-7、M-8 和 CSF1P0;第三組：vWA、M-9 和 Jar idl。
[0050] 所述三組中可以分別標記為FAM或熒光素、HEX或J0E、TMR或VIC。
[00511所述第一組的標記為FAM或熒光素;所述第二組標記為HEX或JOE;所述第三組標記 為TMR或VIC。
[0052]所述的擴增組合物還包括:PCR反應緩沖液和Taq酶。
[0053]小鼠短串聯(lián)重復序列的檢測試劑盒，包括上述擴增組合物。
[0054]所述擴增組合物引物的用量體積比為：
[0055]
[0056]^上述試劑盒在小鼠細胞鑒別中的應用。
[0057]本發(fā)明的優(yōu)勢在于：
[0058] 1. 一次性擴增10個小鼠 STR位點和性別判定位點，能得到大量的信息。
[0059] 2.小鼠 STR位點選用核心序列四堿基重復，Stutter峰低，易于判別細胞是否存在 交叉污染。
[0060] 3.增加了 2個人源STR位點，可判別人鼠細胞交叉污染。
[0061] 4.各個位點采用熒光標記的引