一種篩選人類egfr基因多態性的引物組、試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及由等位基因特異性擴增(ASA)、重組酶聚合酶擴增 (RPA)、肽核酸(PNA)結合DNA技術以及SYBR GreenI顯色組合而成的一種快速且準確篩選人 類EGFR基因多態性(單個核苷酸多態性和基因缺失）的新方法。
【背景技術】
[0002] 快速、準確并且簡便的基因多態性篩查方法一直受到廣泛的重視。人類基因組是 一個十分穩定的體系，不同的民族、群體和個體都有46條染色體，有相同數目的基因和基因 分布，也有基本相同的核苷酸序列。正是基因組結構的這種穩定性保證了人類作為一個物 種的共同性和穩定性，也決定了目前基因組測定是有意義的，即有代表性的。
[0003] 然而人類基因組又是一個變異的體系。在長期進化的過程中，基因組的DNA序列不 斷地發生變異。這些變異可能是有害的、有益的或中性的，它們其中的一些被保存下來，導 致了不同種族、群體和個體間基因組的差異或多態性。除了同卵雙生子外，沒有兩個個體的 基因組是完全相同的。
[0004] 表皮生長因子受體(EGFR)的基因多態性通常是發生在19號染色體缺失（E746-A750)和21號染色體L858R點突變(最普遍的單個核苷酸多態性），到目前為止，基于聚合酶 鏈反應(PCR)擴增DNA的測序技術已成為一個標準技術，然而，由于該標準技術需要大型的 設備和復雜的實驗步驟，包括熱循環設備和DNA測序設備等，目前的分子篩選方法仍然大大 阻礙該基因多態性檢測的效果。
[0005] 目前，等溫酶擴增DNA系統包括基于核酸序列的擴增，環介導等溫擴增（LAMP)，滾 環擴增和解旋酶依賴性擴增。最近，智能擴增方法(SMAP)被開發用于篩選EGFR多態性，但其 復雜的引物設計，大型設備和對操作人員的專業性高要求是其操作缺點。與此相反，重組酶 聚合酶擴增(RPA)是一種較為先進的DNA擴增方法，反應溫度為37°C，引物設計簡便，并具有 更快的擴增速度，能得到大量產物。此外，通過ATP水解作用來促進鏈置換擴增使基因擴增 方法變得更為有趣和實用。RPA可以適用于擴增不同的DNA和RNA，隨著等溫擴增核酸新技術 的逐漸產生，重組酶聚合酶擴增以其極快的擴增速度備受矚目。
[0006] 重組酶聚合酶擴增(RPA)最突出的特點是利用重組酶與引物寡DNA的結合，尋找到 目的序列，在單鏈結合等蛋白作用下低溫（36-40°C)打開雙鏈DNA，具有高特異性、高敏感 性，能夠快速產出目的DNA片段。遺憾的是，RPA擴增方法還沒有被用于快速篩選人類基因 多態性。并且，在單個核苷酸多態性的篩選中更是需要大型、精密的儀器或者高端科學及人 才。目前基因多態性的篩選都還停留在以實時定量PCR為基礎的方法中，而且并不能普及。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是克服上述不足問題，提供一種實用可靠的篩選基因多態性的引物 組、其試劑盒及其檢測方法，本發明在特異性、敏感性、簡便性和即時篩選等方面都具有很 大優勢。本發明是基于等位基因特異性擴增(ASA)，重組酶聚合酶擴增(RPA)，肽核酸(PNA)， 和SYBR Green I染料，即AS-RPA-PNA-SYBR(ARPS)系統的基因篩選新方法，目的是識別EGFR 基因多態性，這可用于對EGFR多態性的篩選。該系統中的ASA/AS理論，RPA擴增，PNA和SYBR Green的結合，不需要任何大型設備，或側流篩選試紙等的精密試劑。只需要用本試劑盒中 已設計好的引物組和擴增緩沖液，即可進行篩選檢測。預計這種方法將是未來篩選基因多 態性，與基因篩查發展愿望相一致的可靠的且具有低成本效益的快速篩選方法。
[0008] 本發明組合運用了等位基因特異性擴增(ASA)、重組酶聚合酶擴增(RPA)、肽核酸 (PNA)結合DNA和SYBR GreenI顯色四種分子生物學方法。以EGFR多態性為篩選對象，進行基 因多態性篩選方法的研究。
[0009] 在本發明的引物篩選方面，重組酶聚合酶擴增引物的設計要求是
[0010] (1)引物長度在30-40個堿基內
[0011] (2)擴增片段長度最好在150-300個堿基內
[0012] (3)引物的3'端避開第三位密碼子(正向和反向引物最好都避免）
[0013] (4)PNA的設計以PNA與非靶序列結合的Tm值(熔解溫度，主要由PNA的長度和堿基 序列決定)和設計的PNA片段的特異性(不與其他序列結合)為標準。
[0014] 根據上述篩選標準，本發明所述的篩選人類EGFR基因多態性的引物組，其核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1~2或者SEQ ID N0.3~5所示。
[0015] 本發明還設計一種篩選人類EGFR基因多態性的試劑盒，其包括上文所述的引物組 之外，還包括檢測試劑，即：核苷酸序列為SEQ ID NO. 1~2和/或者SEQ ID N0.3~5所示的 引物，重泡脹緩沖液、醋酸鎂溶液、SYBR GreenI溶液及含有凍干擴增酶的EP管。
[0016] 此外，在上文所述的試劑盒中，還可以包括記載檢測待測樣品方法的說明書。
[0017] 同時，上文所述的試劑盒中，還可以包括陽性質控DNA:濃度為150ng/2yL的HCC-827細胞系DNA;陰性質控DNA:濃度為150ng/2yL的A549細胞系DNA。
[0018] 在檢測篩選15個堿基缺失的EGFR19Del(2)多態性中，不需要利用PNA-DNA抑制背 景擴增，即只需要利用等位基因特異性重組酶擴增技術即可;在檢測篩選單個核苷酸多態 性如EGFRL858R多態性中，由于重組酶擴增速度非常快，需要預先利用PNA與樣本DNA中非點 多態性的片段結合，使其形成的PNA-DNA復合體在36-40°CRPA擴增中不會因為單鏈結合蛋 白等因素而分開，使聚合酶不能識別并打開PNA-DNA復合物以抑制非特異性擴增。而SYBR也 不能識別PNA，所以不必擔心因為PNA而產生假陽性結果(應為陰性黃色結果而顯綠色）。
[0019]利用上文所述的篩選人類EGFR基因（15個堿基缺失的EGFR19De 1⑵）多態性的引 物組SEQ ID NO. 1~2的檢測方法，其操作步驟包括：
[0020] 將12yL雙蒸水、2yL的濃度為10μΜ的正向引物SEQ ID N0.1、2yL的濃度為10μΜ的反 向引物SEQ ID N0.2、2yL的濃度為150ng/yL的樣本DNA和29.5yL重泡脹緩沖液 (rehydration buffer)加入到含有凍干擴增酶(TwistDX,Cambridge，UK)的EP管中，混勾后 再向其中加入2.5yL濃度為280mM的醋酸鎂溶液混勻、擴增至少5min，再按照每20yL產物應 用1 yL的比例，加入濃度為200X的SYBR Green I。優選的情況下，應用上述檢測方法的時候， 除了樣本DNA外，還可以包括對陽性質控DNA和陰性質控DNA的檢測，且更為優選的擴增時間 為15min〇
[0021] 利用上文所述的篩選人類EGFR基因（EGFRL858R)多態性的引物組SEQ ID NO. 3~5 的檢測方法，其操作步驟包括：
[0022] 將 10yL雙蒸水、2yL的濃度為20μΜ的PNA SEQ ID Ν0.5、2μΙ^?度為 150ng/yL的樣本 DNA，預先進行99°C解鏈2min，66°C結合2min，再加入2yL的濃度為ΙΟμΜ的正向引物SEQ ID NO. 3、2yL的濃度為ΙΟμΜ的反向引物SEQ ID NO. 4，和29.5yL重泡脹緩沖液加入到含有凍干 擴增酶的E P管中，混勻后再向其中加入2.5 μ L濃度為2 8 0mM的醋酸鎂溶液混勻、擴增至少 lOmin后獲得擴增產物，再按照每20yL擴增產物應用lyL的比例，加入濃度為200X的SYBR GreenI〇
[0023] 優選的情況下，應用上述檢測方法的時候，除了樣本DNA外，還可以包括對陽性質 控DNA和陰性質控DNA的檢測，且更為優選的擴增時間為15min。
[0024] 為了進一步驗證采用SYBR GreenI顯色結果是否準確，可以輔以瓊脂糖凝膠電泳 檢測的方法進行驗證，即：將利用上述方法擴增15min后獲得的擴增產物中取出30yL加入 100yL無水乙醇后12000rpm/min，離心5min，去除液體純化RPA擴增產物(此步驟目的為去除 擴增緩沖液，便于瓊脂糖凝膠電泳的檢測）后，再加入30yL雙蒸水，最后進行瓊脂糖凝膠電 泳檢測條帶結果。
[0025]利用上文所述的試劑盒及試劑盒的使用方法篩選組織標本時。可以以陽性質控 DNA和陰性質控DNA為對照品，白色背景為篩選環境，篩選冰凍組織樣本中基因多態性情況。 混勻SYBR顯色劑之后，結果顯示陽性質控DNA產生肉眼可見的綠色熒光并且陰性質控DNA顯 示黃色，表明本實驗結果可靠，樣品DNA的陽性結果為肉眼可見的綠色熒光，陰性結果為不 變的黃色(不變色）。
[0026]本發明另一目的在于，利用上文所述的引物組在制備篩選人類EGFR基因多態性的 檢測試劑中的應用。
[0027]有益效果
[0028]本發明方法利用RPA極為快速的擴增技術，并結合ASA特異性方法可在最短5min內 (樣本中無干擾組織的理想情況下)篩選出EGFR19Del多態性。
[0029]本發明方法將PNA預先與模板DNA結合，然后利用RPA極為快速的擴增技術，并結合 ASA特異性擴增方法可在最短1 Omin內（樣本中無干擾組織的理想情況下）篩選出EGFRL858R 點多態性。發現RPA主要擴增酶gp32和Bsu無法區別多態性與正常樣本DNA(結果顯色均為陽 性），但是擴增酶無法打開預先與非多態性DNA結合的PNA-DNA復合物，從而RPA擴增反應無 法擴