一種禽源沙門氏菌多重pcr檢測試劑盒及其非診斷性檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學檢測技術領域，涉及一種禽源沙門氏菌多重PCR檢測試劑 盒及其非診斷性檢測方法，特別涉及血清型為腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙 門氏菌。
【背景技術】
[0002] 沙門氏菌是一種重要的人畜共患病原菌，主要寄居于人和動物的腸道中，研究表 明由沙門氏菌引起的食物中毒是所有細菌性食物中毒中比例最高、危害最廣的一種。世界 衛生組織(WHO)的調查表明全球每年有1.3 X 108例人類胃腸炎是由沙門氏菌感染引起的， 其中死亡病例高達300萬。
[0003] 家禽被認為是沙門氏菌的主要儲庫，而人類感染通常歸因于受污染的家禽制品 (包括禽肉與禽蛋）。目前已報道的沙門氏菌血清型總數超過2600種，其中與家禽相關的血 清型只占10%，而引起家禽嚴重感染及食品安全的血清型主要包括腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙 門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌三種。腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌主要通過糞口途徑感染家 禽，經過消化道定植后再侵入包括生殖道在內的多種臟器。因此，腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙 門氏菌可以感染雞蛋進而傳播給人類，造成嚴重的公共衛生問題。與此相反的是，雞傷寒沙 門氏菌屬于宿主特異性血清型，可引起各種年齡段雞發生嚴重的系統性疾病，給家禽業造 成嚴重的經濟損失。由于上述三種血清型沙門氏菌在公共衛生和家禽生產領域的重大影 響，腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌已成為全球家禽領域最急需凈化的 血清型。鑒于上述血清型沙門氏菌對家禽生產與公共衛生的重要性，迫切需要建立一種快 速、實用的方法進行特異性檢測。
[0004] 由于傳統沙門氏菌檢測技術上存在諸多缺陷，如:操作步驟煩瑣耗時（需依次經過 預增菌，選擇性增菌，生化與血清學鑒定），不能滿足及時有效的質量監測和疾病防控需求； 靈敏度較低，當樣品中沙門氏菌含量較低時，易造成假陰性結果;準確度不高，尤其是加工 后的食品受加熱、干燥、高鹽和冷凍等因素的作用，易導致沙門氏菌形成營養缺陷型，用傳 統方法不易檢出。
[0005] 為了能夠快速、準確、簡便的檢驗上述三種禽源沙門氏菌，以分子生物學為基礎的 檢測鑒定方法在實踐檢驗中不斷取得新進展，成為取代傳統檢測方法最具潛力的檢測方法 之一。其中，多重PCR技術在保留了PCR方法敏感、特異、簡便、快速等優點的同時，以其高效 性成為了多病原同時檢測的重要技術之一。但由于多重PCR實驗設計較單一 PCR更為復雜， 在建立多重PCR反應體系時需考慮引物間的相互干擾，還需對其中的主要成分和反應條件 進行繁瑣的優化，因而限制了該方法的廣泛運用。
[0006] 本發明根據已知的沙門氏菌全基因組序列，通過分析篩選出腸炎沙門氏菌、雞傷 寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌三種血清型的特有基因序列，設計多重PCR引物，建立檢測方 法。該方法可用于禽源樣品中腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的特異性 檢測。
【發明內容】
[0007] 本發明針對傳統技術在檢測禽源沙門氏菌中存在的不足，提供了一種特異性檢測 三種重要禽源沙門氏菌血清型(腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌）的多重 PCR試劑盒及其非診斷性檢測方法。
[0008] 本發明技術方案如下： 本發明提供了一種禽源沙門氏菌多重PCR檢測試劑盒及其非診斷性檢測方法，所述禽 源沙門氏菌多重PCR檢測試劑盒包括10XPCR緩沖液、2.5 U/μΙ Taq DNA聚合酶、10Mm dNTPs、多重PCR檢測引物組、陽性對照和陰性對照，所述陽性對照物包括腸炎沙門氏菌 ATCC13076、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、雞傷寒沙門氏菌ATCC9184基因組DNA;所述陰性對 照為滅菌雙蒸水。
[0009] 進一步的，所述多重PCR檢測體系的組分為:每25μ1反應液中包括10XPCR緩沖液 2.5yl、dNTPs 2yl、Taq DNA聚合酶0.25μ1、檢測引物組3yl、DNA模板1~2μ1以及適量的滅菌 雙蒸水。
[0010] 進一步的，所述多重PCR檢測方法程序為:94°C預變性5min;94°C變性 30s;56°C退火30s;72°C延伸30s;共30個循環，最后72°C延伸8min。
[0011]進一步的，所述 10XPCR緩沖液含有 100mM KCl、80mM (NH4)S〇4、pH為9.0的 100mM Tris-HCl、15mM MgCh和0.5% Tergitol-type NP-40〇
[0012]進一步的，所述陽性對照中腸炎沙門氏菌的擴增引物序列為SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，雞傷寒沙門氏菌的擴增引物序列為SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，鼠傷寒沙門 氏菌的擴增引物序列為SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。
[0013] 進一步的，所述腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌的引物對濃度均 為10 μΜ，等體積混合后得到檢測引物組。
[0014] 進一步的，所述dNTPs包括dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各組分濃度均為2.5mM。
[0015] 更進一步的，一種使用禽源沙門氏菌多重PCR檢測試劑盒進行非診斷性檢測的方 法，包括以下步驟： S1:使用煮沸法或商品化試劑盒提取細菌基因組DNA，得到檢測模板。
[0016] 32:多重?0財廣增，將10\?0?緩沖液、(1犯1^、了&9〇嫩聚合酶、檢測引物組以及0嫩 模板加入無菌PCR反應管中，添加滅菌雙蒸水至總體積25μ1，同時設置陽性、陰性對照，使用 PCR儀進行擴增反應;采用2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行電泳檢測并分析結果。
[0017]相比于現有技術，本發明的有益效果為： 本發明根據三種禽源沙門氏菌(腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌)含 有的特異基因序列設計引物，具有靈敏度高，特異性強的優點，同時，本發明通過一次反應， 即可對三種家禽主要優勢血清型沙門氏菌進行快速檢測與分型，相比傳統的血清學分型與 普通PCR檢測，在檢測時間與檢測成本方面具有較大優勢，適合于批量檢測。
【附圖說明】
[0018]圖1為實施例1中多重PCR檢測方法的凝膠電泳展示圖。圖中:Μ為DL-500 marker， 泳道1-3分別為鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌，泳道4為陰性對照； 圖2為實施例2中多重PCR檢測方法特異性評價實驗凝膠電泳結果圖。圖中:M為DL-500 marker;泳道1-39為沙門氏菌標準株檢測結果，分別為紐波特沙門氏菌ATCC6962、蒙特維的 亞沙門氏菌ATCC8387、圣保羅沙門氏菌CICC21486、波茨坦沙門氏菌CICC21500、布洛克利沙 門氏菌CICC21489、雞傷寒沙門氏菌ATCC10398、海德爾堡沙門氏菌CMCC50111、肯塔基沙門 氏菌CICC21488、嬰兒沙門氏菌CMCC50348、湯卜遜沙門氏菌CMCC50023、阿貢納沙門氏菌 CICC21586、雞傷寒沙門氏菌ATCC19945、山夫登堡沙門氏菌CMCC50050、亞利桑那沙門氏菌 CMCC50166、火雞沙門氏菌CMCC50329、科特布斯沙門氏菌CMCC50123、都柏林沙門氏菌 CMCC50042、雷丁沙門氏菌CMCC50103、雞傷寒沙門氏菌ATCC9184、德比沙門氏菌CMCC50112、 鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、甲型副傷寒沙門氏菌CMCC50001、埃森沙門氏菌CMCC50720、吉 夫沙門氏菌CMCC50773、鴨沙門氏菌CMCC50774、弗雷斯諾沙門氏菌CMCC50908、斯特拉斯堡 沙門氏菌CMCC50872、腸炎沙門氏菌ATCC13076、豬霍亂沙門氏菌CICC21493、鼠傷寒沙門氏 菌CMCC50015、明尼蘇達沙門氏菌CMCC50061、巴森海德沙門氏菌CICC21587、巴雷利沙門氏 菌CMCC50740、圣地亞哥沙門氏菌CMCC50716、加明那拉沙門氏菌CMCC50141、雞傷寒沙門氏 菌CMCC50770、翁德斯太浦沙門氏菌CMCC50138、奧拉寧堡沙門氏菌CMCC50121和腸炎沙門氏 菌CMCC50041;泳道40-47為非沙門氏菌標準株檢測結果（分別為禽多殺性巴氏桿菌 CVCC44801、奇異變形桿菌ATCC12453、大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌 ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853、宋內氏志賀氏菌ATCC9290、空腸彎曲桿菌ATCC12022 和肺炎克雷伯氏菌ATCC700603;泳道48為滅菌雙蒸水。
[0019]圖3為實施例3中多重PCR檢測方法靈敏度評價實驗凝膠電泳結果圖。圖中:M為DL-500 marker， 泳道 1-5 為鼠傷寒沙門氏菌 ATCC14028 梯度稀釋樣品 ，泳道 6-10 為雞傷寒沙門 氏菌ATCC9184梯度稀釋樣品，泳道11-15為腸炎沙門氏菌ATCC13076梯度稀釋樣品。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合實施例和附圖對本發明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發明的較 佳實施例而已，并非對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上 述揭示的技術內容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發明方案內容，依據 本發明的技術實質對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發明的保護范 圍內。
[0021] 實施例1禽源沙門氏菌多重PCR檢測方法的建立 引物的設計:根據GenBank數據庫中已有的腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙 門氏菌的基因組DNA序列，分析比對后分別篩選出上述三種血清型沙門氏菌的特異性基因 片段（SEQIDN0.1、SEQIDN0.4、SEQIDN0.7)，再此基礎上設計、優選得到三種血清型沙 門氏菌的特異性檢測引物，如下表所示。
[0022] 多重PCR檢測引物組中腸炎沙門氏菌的擴增引物序列SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、 雞傷寒沙門氏菌的擴增引物序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、鼠傷寒沙門氏菌的擴增引物 序列SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9的完整SEQ序列如序列表中所示。