霍亂弧菌熒光pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[00011本發明涉及一種采用實時熒光PCR方法特異性檢測樣品中霍亂弧菌(01群和0139 群)核酸的試劑盒，屬于霍亂弧菌的體外診斷領域。
【背景技術】
[0002] 霍亂弧菌(Vibrio cholerae)是革蘭氏陰性菌，菌體如弧狀，一端有鞭毛;霍亂弧 菌有耐熱的0抗原，根據0抗原的不同，分成139個血清型，其中01群和0139型能引起霍亂流 行。
[0003] 霍亂主要為小腸疾患，人是霍亂弧菌的唯一易感者，經口感染，通過胃到達小腸， 借助鞭毛的運動穿透粘膜層，依靠菌毛等黏附因子黏附于黏膜細胞表面，在此繁殖并產生 霍亂腸毒素。
[0004] 霍亂腸毒素致病機理如下：毒素由A和B兩個亞單位組成，A亞單位又分為A1和A2兩 個肽鏈，兩者依靠二硫鍵連接;A亞單位為毒性單位，其中A1肽鏈具有酶活性，A2肽鏈與B亞 單位結合參與受體介導的內吞作用中的轉位作用;B亞單位為結合單位，能特異地識別腸上 皮細胞上的受體；1個毒素分子由一個A亞單位和4-6個B亞單位組成多聚體。霍亂腸毒素作 用于腸細胞膜表面上的受體（由神經節苷脂GM1組成），其B亞單位與受體結合，使毒素分子 變構，A亞單位進入細胞，A1肽鏈活化，進而激活腺苷環化酶(AC)，使三磷酸腺苷(ATP)轉化 為環磷酸腺苷(cAMP)，細胞內cAMP濃度增高，導致腸粘膜細胞分泌功能大為亢進，使大量體 液和電解質進入腸腔而發生劇烈吐瀉，由于大量脫水和失鹽，可發生代謝性酸中毒，血循環 衰竭，甚至休克或死亡。
[0005] 在檢測中，PCR法由于其快速簡便的特點逐漸呈現出要替代以細菌培養和血清學 檢測為主的傳統檢測方法的趨勢。而對于PCR方法來說，引物的特異性是其檢測特異性和敏 感性的基礎。
[0006] 本發明分別針對霍亂弧菌01群和0139群基因序列的保守區域特異的靶序列設計 弓丨物和Taqman探針，利用real-time PCR的方法，用來快速檢測樣品中是否存在霍亂弧菌01 群和0139群的核酸。
【發明內容】
[0007] 本發明主要解決的技術問題是快速準確地檢測樣品中是否存在霍亂弧菌(01群和 0139群），提供一種特異性檢測白喉棒狀桿菌的熒光PCR試劑盒。
[0008] 本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的： 一種特異性檢測樣品中霍亂弧菌核酸的試劑盒，包括PCR反應液、酶混合液、陰性質控 品和陽性質控品。其中PCR反應液主要含有上述的引物和探針、反應緩沖液、Mg2+和dNTP等， 酶混合液主要含有熱啟動Taq酶，陰性質控品為無 RNase和DNase水，陽性質控品為含01和 0139群霍亂弧菌特異性擴增位點的重組質粒。
[0009] PCR反應液中用于核酸擴增的引物為P1和P2，P1-1和P1-2為針對霍亂弧菌01群基 因組特異性保守序列設計并經預實驗篩選出的特異性引物，P2-1和P2-2為針對霍亂弧菌 0139群基因組特異性保守序列設計并經預實驗篩選出的特異性引物;PCR反應液中用于熒 光信號監測的寡核苷酸探針為Pr 〇bel、2，Pr〇bel為針對霍亂弧菌01群基因組特異性保守序 列設計并經預實驗篩選出的特異性探針，Probe2為針對霍亂弧菌0139群基因組特異性保守 序列設計并經預實驗篩選出的特異性探針，其中Probel熒光報告基團XiSFAM，熒光淬滅基 團Y^Eclipse，Probe2熒光報告基團X 2為CY5，熒光淬滅基團Y2為BHQ(見表1)。
[0010]表1檢測霍亂弧菌的引物和探針序列
本發明的另一個目的是提供本熒光PCR檢測試劑盒在檢測霍亂弧菌的應用方法，包括： 試劑盒選用的PCR反應體系為20 μL，包括2XPCR緩沖液10 yUlOmmol/L dNTP 1.0 μ 1、25_〇1/1引物各0.5 yUlOymol/L探針0.2 μL、熱啟動Taq酶混合液0.4 μL、樣品DNA 2μ 1，加滅菌水至終體系20 μL。
[0011] 試劑盒的PCR反應循環參數為94°C，2min;進入循環階段:94°C變性10s，56°C退火 50s，72 °C延伸15s，共反應40個循環。
[0012] 質量控制:每次實驗應設立陰、陽性對照，陰性對照無 Ct值(或Ct值為0)，陽性對照 Ct值< 30，否則實驗結果不成立。
[0013] 結果判讀： 陽性：出現"S"型擴增曲線，Ct值< 35;可疑：出現"S"型擴增曲線，但Ct值> 35;陰性:沒 有出現"S"型擴增曲線，或者曲線雖然超過了閾值，但不呈"S"型;對可疑結果，應重復實驗， 如果重復實驗還是出現"S"型擴增曲線，陰性對照沒有污染，可判斷為陽性。
[0014] 樣本要求：臨床樣本類型包括患者腹瀉標本和分離培養物；臨床樣本采集后應帶 冰運輸，_20°C保存，不能反復凍融;從臨床樣本提取DNA，建議采用性能穩定可靠的商品化 試劑盒，具體方法參見相應商品化試劑盒說明書，提取的DNA應立即檢測，否則，應將DNA分 裝后-80°C~_20°C保存。
[0015] 本發明提供的試劑盒具有很好的特異性，可以用于霍亂弧菌的定性檢測，同時可 以區分01和0139血清群，但不能檢出非霍亂弧菌病原體的核酸；對霍亂弧菌核酸01群和 0139群的檢測下限均為100拷貝每反應體系；只需2小時即可完成檢測，可為霍亂弧菌的疾 病監測和臨床診斷提供實驗依據。
【附圖說明】
[0016] 圖1和圖2分別為單重實時熒光PCR檢測霍亂弧菌01群和0139群陽性標準品的擴增 曲線圖。從左至右的每組曲線對應濃度依次為2 X 107-2 X 103 copies/μL，試劑盒對霍亂弧 菌的檢測限均為100拷貝每反應體系。橫坐標為反應循環數，縱坐標為不同循環數熒光檢測 信號的A Rn值。
[0017] 圖3為雙重實時熒光PCR檢測體系檢測10種細菌基因組DNA的擴增曲線圖。10種細 菌包括:霍亂弧菌和9種陰性對照微生物。霍亂弧菌出現S型擴增曲線，而其他9種病原微生 物未出現S型擴增曲線。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合具體實施例詳細說明本發明的優選實施方式。需要指出的是，這里列出 的實施例僅僅為示例性說明的目的，而不應將其解釋為對本發明范圍的任何限制。其中使 用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實施例中具體選擇的試劑，應理解，本領域技術人 員可根據需要選擇其他公司的相應試劑以實現本發明的目的。
[0019]引物和TaqMan探針的設計與合成 利用Blast工具對Genbank和國內外文獻中的霍亂弧菌01和0139血清群基因組序列進 行分析，分別選擇其穩定的保守區域作為檢測靶序列。霍亂弧菌01群檢測靶序列為酰基輔 酶A還原酶基因，霍亂弧菌0139群檢測靶序列為0RF71x8基因；并針對檢測靶序列設計和合 成引物和探針(見表1)。引物和探針均由日本TaKaRa大連寶生物公司合成，霍亂弧菌01群的 檢測探針5'端標記FAM熒光基團，3'端標記Eclipse熒光淬滅基團；霍亂弧菌0139群的檢測 探針5 '端標記CY5熒光基團，3 '端標記BHQ熒光淬滅基團。
[0020] 檢測菌種的準備 本實施例中所使用的霍亂弧菌以及其他陰性對照菌株(副溶血弧菌，鼠疫耶爾森菌，小 腸結腸炎耶爾森菌，痢疾志賀菌，福氏志賀菌，大腸桿菌，大腸埃希菌，沙門氏菌，鮑氏志賀 菌菌)均購買于中國藥品生物制品檢定所。
[0021] 菌株DNA的抽提 選用Qiagen公司QIAamp DNA Mini Kit(貨號：51306)提取菌株DNA。具體步驟參考試劑 盒操作說明書。
[0022]引物和探針的篩選 采用設計的引物和探針檢測提取的霍亂弧菌和陰性對照菌株的基因組DNA，經反復實 驗，篩選出靈敏度、特異性和重復性最佳的引物探針組合。（見序列表，霍亂弧菌01群(正向 引物P1-1、反向引物P1-2和探針Probel)，霍亂弧菌0139群(正向引物P2-1、反向引物P2-2和 探針Probe2))。
[0023] 標準品的構建與制備 分別利用P1