一種檢測煙草炭疽病定殖量的熒光定量pcr檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種檢測煙草炭疽病定殖量的熒光定量PCR檢測方法，適用于各種感病煙株中的煙草炭疽病菌的定量檢測。
【背景技術】
[0002]煙草炭疽病于1922年由巴西首次報道以后，德國、日本、美國、中國、澳大利亞、印度、朝鮮和非洲也相繼發現。此病在煙草各生育期皆可發生，但以苗期發生普遍而嚴重。幼苗葉片病斑密布，嚴重發病時往往使整片煙苗毀掉，一般發病時雖不至于苗毀，但幼苗生勢差，而且移栽大田后仍可繼續為害，招致較大損失。我國煙區均有此病發生。
[0003]受害初期，葉片上發生暗綠色水漬狀的小點，2?3天內就擴大成直徑約2?5毫米的圓形病斑。病斑中間呈灰白色或黃褐色，稍凹陷，邊緣略隆起，呈赤褐色。潮濕時病斑上產生輪紋和小黑點。病斑密集時常互相愈合使葉片枯黃而死，煙葉扭縮或枯焦。主脈、葉柄和莖部的病斑呈梭形，一般較葉上的病斑大，中間常開裂，呈黑褐色。煙苗在2?3片真葉期以前最易受病，能致幼苗迅速枯死。在成株上，病斑首先在底葉上發生;花萼和蒴果有時亦能被害而形成不規則形褐色的病斑。
[0004]真菌的rDNA.1TS序列具有保守性，同時在屬間、種間存在著廣泛的多態性。利用rDNA ITS區特異性片段的特異性擴增技術，在病原真菌的分類鑒定、病原檢測中的廣泛的應用(劉春來等，2007)。根據基因序列的差異進行真菌鑒定和系統發育的研究已成為植物病原學的研究熱點(Pantou MP等，2003;Hermosa M R等，2000;Levy L等2001)。
[0005]目前對梨輪紋病和梨炭疽病常用的監測方法是觀察果實、葉片和枝條的發病狀況，病原菌分離純化后培養產孢，觀察孢子形態特征等。這些方法費時，誤差較大。例如梨輪紋病和梨炭疽病發病時果實和葉片的癥狀相似，運用傳統的監測方法難以區分。
【發明內容】
[0006]針對現有技術存在的缺陷，本發明提出一種檢測煙草炭疽病定殖量的熒光定量PCR檢測方法，能夠提高檢測效率，提高病菌的診斷準確性。
[0007]為實現上述目的，本發明提出一種檢測煙草炭疽病定殖量的熒光定量PCR檢測方法，包括如下步驟:
(1)熒光定量核酸擴增反應體系的配制:在反應管中加入正向LNA引物、反向LNA引物、模板DNA、和2 X熒光定量PCR反應混合液，增加ddH20至反應體系為25μ1，混合均勻；
(2)熒光定量核酸擴增:將所述步驟(I)得到的混合溶液置于熒光定量檢測儀上進行反應；
(3)反應結束后，將模板DNA的循環閾值C(t)與標準曲線對照，得到模板DNA中的18S核糖體RNA片段拷貝的濃度。
[0008]所述的正向引物和反向引物的序列如下:
上游引物序列為:CGTTTCTTCTGAGTGGCACA，下游引物 TTGAAATGACGCTCGAACAG。
[0009]所述的正向引物和反向引物的終濃度均為25μΜ。
[0010]所述的步驟(2)的反應條件為950C熱啟動8分鐘預變性后;進入擴增循環:95V30秒，58°C 1秒，72 °C 20秒;循環45次。
[0011 ]隨著分子生物學的發展，各種分子生物學技術在真菌病害研究中廣泛應用，主要有RAI3D、RFLP、AFLP、ap.PCR、rDNA序列分析和特異性引物的PCR檢測等。核糖體基因ITS序列在真菌種間的高度變異和種內的穩定性，為病原菌分子診斷提供了靶序列，該技術已在草莓和辣椒炭疽菌(ColIeto—trichum)Dt-12]，松干銹菌(Puccinia)，大豆、苜蓿、芒麻疫霉菌(Phytophthora)等病原菌的鑒定、分類和系統發育研究方面得到廣泛應用。
[0012]本發明根據煙草炭疽病菌rDNAITS區序列設計特異性引物，并對其特異性進行了驗證，同時對其在病害檢測中的應用進行了探討。
[0013]應用BeaconDesigner 引物設計軟件，參照Col letotrichum nicotianae 18Sribosomal RNA gene(377823950 | gb | JN837677.I)基因序列設計一對引物，上游引物序列為:CGTTTCTTCTGAGTGGCACA下游引物TTGAAATGACGCTCGAACAG預計擴增的目的片段長度為193bp。引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。
[0014]1.5 DNA模板的提取及擴增序列的鑒定
根據天根基因組DNAA提取試劑盒說明書提取感病煙葉組織DNA，-20 V保存。
[0015]熒光定量PCR反應體系的配制:在反應管中加入0.4μ1正向引物10μΜ、0.4μ1反向引物10μΜ、0.5ul模板DNA (lOng/μΙ)、和ΙΟμΙ 2 X熒光定量PCR反應混合液，增加ddH20至反應體系20μ1，混合均勻。
[0016]熒光定量PCR核酸擴增:將所述步驟(I)得到的混合溶液置于熒光定量Lightcycler 480II檢測儀上進行反應;反應條件:95°C5分鐘預變性;95°(:10秒，58°C 10秒，72 0C 20秒，做45個循環，溶解曲線分析:從65 °C開始至95 °C結束，以0.2 °C /秒讀取熒光值。陽性模板為包含所述18S ribosomal RNA及其相鄰區域片段的質粒克隆而成，并梯度稀釋成IX 107，I X 106，I X 105，I X 104，I X 103拷貝/μI，每次PCR反應各梯度陽性模板均與土壤提取的DNA樣本同時進行擴增，以繪制陽性標準曲線對樣本定量(見圖1)，每輪熒光定量PCR反應均同時做陰性對照和空白對照。
[0017]SYBR Green I實時熒光定量PCR擴增及標準曲線的制備
用核酸計數儀測量所提18S ribosomal RNA及其相鄰區域片段的質粒(377823950JN837677.1)的DNA濃度。計算標準品的拷貝數。按10倍梯度稀釋，將其作為實時熒光定量PCR模板進行熒光定量PCR擴增。建立25ul反應體系:SYBR Green I 12.5ul，下游引物Iul，上游引物Iul，模板DNA lul，加超純水至25ul。熒光PCR循環條件為:95°C30s預變性，95°C208，581€308，721€308，進行40個循環，利用隨機軟件進行分析，得到溶解曲線和標準曲線。
[0018]將7X 106拷貝/ul稀釋液作為反應的起始濃度，然后做10倍梯度稀釋。以7 X 106—7 X 102為模板，進行熒光定量PCR檢測，以超純水代替模板做陰性對照，檢測熒光定量PCR反應的最低模板拷貝數。
[0019]將Iul上面提取的感病煙株DNA溶液作為模板，采用同樣的定量PCR體系進行PCR，條件同上，當擴增出基因片段為25Ibp的產物時，記錄此時待測DNA的CT值，將該CT值帶入到步驟(I)繪制出的標準曲線當中，得至IjPCR反應體系中煙草炭疽病菌的拷貝數。根據如下公式計算出煙草炭疽病菌在煙株中的定殖數量。
[0020]N=NPCRXVDNAX(I/WSAMPLE)
Q為PCR反應得到的炭疽病菌濃度，VDNA為對煙株提取的DNA的最終稀釋量，WSAMPLE為提取DNA所用的煙株的組織重量。
[0021]有益效果
本發明的鎖核苷酸(LNA)增敏的煙草炭疽病菌實時熒光定量PCR檢測方法適用于感病煙株中的煙草炭疽病菌孢子數量的定量檢測，且具有以下優勢:
I)檢測時間短，整個檢測過程可在4?5小時之內完成。
[0022 ] 2 )靈敏度:檢測閾值可以達到100個拷貝/μ I。
[0023]3)作過程簡單，標準化操作，降低了初學者的難度。
[0024]4)檢測通量大，在4?5小時內最多可以檢測384例。
【附圖說明】
[0025]圖1是本發明的實施例中的107、1