SEQ ID N0 :1 的 RNAi 載體 pGCSIL-GFP-KIAA0101-siRNA 能夠顯著下調(diào)KIAA0101基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。使用慢病毒（lentivirus， 簡(jiǎn)寫(xiě)為L(zhǎng)v)作為基因操作工具攜帶RNAi載體pGCSIL-GFP-KIAA0101-siRNA能夠靶向地將 針對(duì)KIAA0101基因的RNAi序列高效導(dǎo)入人結(jié)腸癌RK0細(xì)胞，降低KIAA0101基因的表達(dá)水 平，顯著抑制上述腫瘤細(xì)胞的增殖能力。因此慢病毒介導(dǎo)的KIAA0101基因沉默是惡性腫瘤 潛在的臨床非手術(shù)治療方式。
[0064] 本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑 制人KIAA0101基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細(xì)胞，高效率地抑制靶細(xì)胞中 KIAA0101基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力等，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì) 胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0065] 圖 1 :pGCSIL_GFP 質(zhì)粒 DNA 圖譜
[0066] 圖2 :KIAA0101-RNAi慢病毒侵染結(jié)腸癌細(xì)胞4天后，KIAAOlOlmRNA的表達(dá)水平顯 著降低
[0067] 圖3 :KIAA0101-RNAi慢病毒侵染結(jié)腸癌細(xì)胞4天后，引起細(xì)胞增殖抑制
【具體實(shí)施方式】
[0068] 本發(fā)明涉及了一組針對(duì)人KIAA0101基因的小分子干擾RNA(siRNA)序列、RNA干 擾載體和RNA干擾慢病毒。選取人KIAAOlOlmRNA編碼區(qū)序列作為siRNA的靶位點(diǎn)，根據(jù)靶 位點(diǎn)中連續(xù)的10-30(優(yōu)選15-27,更優(yōu)選19-23)個(gè)堿基序列設(shè)計(jì)siRNA靶點(diǎn)序列。通過(guò) 基因克隆，構(gòu)建表達(dá)上述siRNA的核酸構(gòu)建體，包裝表達(dá)上述siRNA的慢病毒。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證 明，上述siRNA序列能夠特異性沉默人腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源KIAA0101基因的表達(dá)。
[0069] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中，KIAA0101基因顯著 高表達(dá)；發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用RNAi方法下調(diào)人KIAA0101基因的表達(dá)后可有效地抑制腫瘤細(xì)胞 的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力等，可以有效地控制腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn) 程，這一研究成果表明KIAA0101基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。發(fā)明人進(jìn)一步 合成和測(cè)試了多種針對(duì)KIAA0101基因的siRNA，篩選出了可有效抑制KIAA0101的表達(dá)進(jìn)而 抑制結(jié)腸癌RK0細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的siRNA，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0070] 本發(fā)明提供了一系列干擾人KIAA0101基因的小干擾RNA(siRNA)序列，構(gòu)建了可 特異性沉默KIAA0101基因表達(dá)的慢病毒。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)人KIAA0101基因設(shè)計(jì)的 小干擾RNA及RNAi慢病毒，穩(wěn)定并特異地下調(diào)KIAA0101基因的表達(dá)，并有效地抑制人腫瘤 細(xì)胞的增殖。本發(fā)明表明KIAA0101基因可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，有望成為腫瘤早期診斷和治 療的靶點(diǎn)。而且，通過(guò)RNAi方式沉默KIAA0101基因的表達(dá)，可作為抑制腫瘤發(fā)展的有效手 段。
[0071] 本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路為：
[0072] 本發(fā)明通過(guò)如下方法來(lái)篩選獲得一種人KIAA0101基因 RNAi慢病毒：從Genbank 中調(diào)取人KIAA0101基因序列；預(yù)測(cè)siRNA位點(diǎn)；合成針對(duì)KIAA0101基因的有效的siRNA序 列、兩端含酶切位點(diǎn)粘端的雙鏈DNA Oligo ;慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNA Oligo連接， 構(gòu)建表達(dá)KIAA0101基因 siRNA序列的RNAi質(zhì)粒；將RNAi質(zhì)粒和慢病毒包裝需要的輔助載 體（Packing Mix，Sigma-aldrich公司）共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞293T，產(chǎn)生重組慢病毒顆粒，即 可制得高效沉默KIAA0101基因的慢病毒。
[0073] 基于上述方法，本發(fā)明提供了 1個(gè)干擾KIAA0101基因的有效靶點(diǎn)（具體如SEQ ID NO :1所示），構(gòu)建了特異干擾人KIAA0101基因的慢病毒。
[0074] 同時(shí)本發(fā)明還公開(kāi)一種人KIAA0101基因 RNAi慢病毒（KIAA0101-RNAi)及其制備 與應(yīng)用。
[0075] 本研究發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi方法，在降低KIAA0101基因在腫瘤細(xì)胞中的 表達(dá)后，可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究表明，KIAA0101基因是一個(gè)原癌基因，可促 進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要的生物學(xué)功能，KIAA0101基因可以為腫瘤 治療的靶標(biāo)，慢病毒介導(dǎo)的KIAA0101基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。
[0076] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非限制 本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說(shuō)明配方的試劑均為按照常規(guī)條 件，如[美]Sambr 〇〇k.J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗(yàn)指南，第三版。北京：科學(xué)出版社 2002中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。
[0077] 實(shí)施例1針對(duì)人KIAA0101基因 RNAi慢病毒的制備
[0078] 1.篩選針對(duì)人KIAA0101基因的有效的siRNA靶點(diǎn)
[0079] 從Genbank調(diào)取KIAA0101基因信息；設(shè)計(jì)針對(duì)KIAA0101基因的有效的siRNA靶 點(diǎn)。
[0080] 表1列出了其中針對(duì)KIAA0101基因的有效siRNA靶點(diǎn)序列。
[0081] 表1靶向于人KIAA0101基因的siRNA靶點(diǎn)序列
[0082]
[0083] 2.慢病毒載體的制備
[0084] 針對(duì)siRNA靶點(diǎn)（以SEQ ID N0 :1為例）合成兩端含Age I和EcoR I酶切位點(diǎn) 粘端的雙鏈DNA Oligo序列（表2);以Age I和EcoR I限制性內(nèi)切酶作用于pGCSIL-GFP 載體（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供，圖1)，使其線性化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切 片段。
[0085] 表2兩端含Age I和EcoR I酶切位點(diǎn)粘端的雙鏈DNA Oligo
[0086]
[0087] 通過(guò)T4DNA連接酶將雙0每切線性化（0每切體糸如表4所不，37Γ，反應(yīng)lh)的載 體DNA和純化好的雙鏈DNA Oligo連接，在適當(dāng)?shù)木彌_體系（連接體系如表5所示）中 于16°C連接過(guò)夜，回收連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化氯化鈣制備的新鮮的大腸桿菌感受態(tài) 細(xì)胞（轉(zhuǎn)化操作參考：分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第二版55-56頁(yè)）。在連接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物長(zhǎng)出菌克 隆表面沾一下，溶于10 μ 1 LB培養(yǎng)基，混勻取1 μ 1作為模板；在以慢病毒載體中RNAi序 列的上下游，設(shè)計(jì)通用PCR引物，上游引物序列：5' -CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3'（SEQ IDN0:6);下游引物序列 ：5'-GTAATACGGTTATCCACGCG-3'（SEQIDN0:7)，進(jìn)行PCR鑒定 實(shí)驗(yàn)（PCR反應(yīng)體系如表6-1，反應(yīng)條件如表6-2)。對(duì)PCR鑒定陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序和比 對(duì)分析，比對(duì)正確的克隆即為構(gòu)建成功的針對(duì)SEQ ID N0 :1的表達(dá)RNAi的載體，命名為 pGCSIL-GFP-KIΑΑ0101-s i RNA。
[0088] 構(gòu)建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA陰性對(duì)照質(zhì)粒，陰性對(duì)照siRNA靶序列為 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'（SEQ ID N0:8)。構(gòu)建 pGCSIL-GFP-Scr-siRNA 陰性對(duì)照質(zhì)粒 時(shí)，針對(duì)Scr siRNA靶點(diǎn)合成兩端含Age I和EcoR I酶切位點(diǎn)粘端的雙鏈DNA Oligo序列 (表3)，其余構(gòu)建方法、鑒定方法及條件均同pGCSIL-GFP-KIAAOlOl-siRNA。
[0089] 表3兩端含Age I和EcoR I酶切位點(diǎn)粘端的雙鏈DNA Oligo
[0090]
[0091] 通過(guò)T4DNA連接酶將雙酶切線性化（酶切體系如表4所示，37°C，反應(yīng)lh)的載體
[0092] 表4 pGCSIL-GFP質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系
[0093]
[0094] 表5載體DNA和雙鏈雙鏈DNA Oligo連接反應(yīng)體系
[0095]
[0096] 表6-1PCR反應(yīng)體系
[0097]
[0098] 表6-2PCR反應(yīng)體系程序設(shè)定
[0099]
[0100] 3.包裝 KIAAOlOl-siRNA 慢病毒
[0101] 以Qiagen公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取RNAi質(zhì)粒pGCSIL-GFP-KIAAOlOl-siRNA的 DNA，配制成lOOng/μ 1儲(chǔ)存液。
[0102] 轉(zhuǎn)染前24h，用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞，以含10%胎牛 血清的DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1. 5 X 105細(xì)胞/ml，接種于6孔板，37°C，5 % C02培 養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)70%-80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2h，吸出原有培養(yǎng)基，加入 1.5ml 新鮮的完全培養(yǎng)基。按照 Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix 試劑盒的說(shuō)明，向一滅菌離心管中加入Packing Mix (PVM) 20 μ 1，PEI 12 μ 1，無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基400 μ 1，取20 μ 1上述抽提的質(zhì)粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。
[0103] 將上述轉(zhuǎn)染混和物在室溫下孵育15min，轉(zhuǎn)移至人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞的培養(yǎng)基 中，37°C，5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16h。棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)介質(zhì)，PBS溶液洗滌，加 入完全培養(yǎng)基2ml。由于慢病毒載體自身帶有綠色熒光蛋白的報(bào)告基因，24h后可置于熒 光顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞GFP的表達(dá)情況，確定慢病毒質(zhì)粒是否已被293T細(xì)胞包裝。繼 續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞上清液，Centricon Plus-20離心超濾裝置（Millipore)純化 和濃