生物催化生產磷酸肌酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及磷酸肌酸的制備方法的技術領域，特別涉及一種利用生物酶催化技術 生產磷酸肌酸的生物催化方法。
【背景技術】
[0002] 磷酸肌酸(phosphocreatine)是在肌肉或其他可興奮組織(如腦和神經）中的一種 高能磷酸化合物，是高能磷酸基的暫時貯存形式。磷酸肌酸的作用非常多，其主要作用有以 下七點：（1)心肌保護劑:磷酸肌酸廣泛地分布于身體各組織，90%在肌肉組織中，磷酸肌酸 是用來維持ATP水平的，磷酸肌酸通過開放合成通路和減少分解作用，保護肌纖維膜免受缺 血損害并維持細胞的核酸儲備。臨床用于心麻痹癥的心臟保護及心肌代謝窘迫的其他狀 況。適用于心肌缺血、肥厚、心梗及心衰的治療(輔助治療），亦可用作各種心臟手術；（2)緩 沖肌肉中酸性物質突然增高；（3)磷酸肌酸(CP)還參與能量運輸，即把能量從線粒體運載到 肌肉的其它部位；（4)運動員首選的運補劑:磷酸肌酸對于增加運動員的體能，提高運動成 績有明顯的效果、安全有效，無副作用。在比賽中，磷酸肌酸(CP)水平的增加能提高訓練和 比賽成績；（5)ATP的貯存形式:磷酸肌酸可以把高能磷酸轉移給ADP生成ATP，因此磷酸肌酸 是ATP的貯存形式；（6)與ADP作用而產生ATP:當體內肌酸磷酸激酶降低至零之前，腦組織缺 氧時，磷酸肌酸均能與ADP作用而產生ATP; (7)緩沖劑的作用:磷酸肌酸除提供能量外，在大 強度練習中還可以對控制肌肉中的酸性物質起緩沖劑的作用，這是因為磷酸肌酸在合成 ATP過程中需要消耗大強度練習中堆積在肌肉中乳酸釋放出來的氫離子，而肌肉中氫離子 過多會阻礙肌肉收縮，所以磷酸肌酸能起緩沖作用并推遲疲勞的出現。
[0003] 現有技術中，磷酸肌酸的生產方法包括化學合成法和生物催化法。化學合成法具 有反應條件苛刻、激烈、不易控制，生成產物復雜，污染環境，合成過程中需要用到有毒且易 燃的原料等缺點；而生物催化法則是以肌酸和ATP為底物，在肌酸激酶的催化下，專一生成 磷酸肌酸，具有反應條件溫和、反應速度快、專一性強及低碳環保等優點。但是，由于肌酸激 酶的活力較低，且來源受限，致使磷酸肌酸的生產成本過高，嚴重制約了磷酸肌酸生物催化 法的規模化和產業化生產。
【發明內容】
[0004] 針對上述【背景技術】中提到的磷酸肌酸現有生產方法存在的缺陷，本發明的目的在 于提供一種產率高、成本低、適于大規模工業化生產的磷酸肌酸的生物催化生產方法。
[0005] 為實現上述目的，發明人對具有如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的Oryctolagus cuniculus肌酸激酶親本基因進行定點突變，PCR擴增后插入適當的載體，隨后在LB培養基 上篩選，從而獲得了具有高催化活性的肌酸激酶突變體，因此，本發明提供了一種生物催化 生產磷酸肌酸的方法，其特征在于：以肌酸和三磷酸腺苷為底物，在肌酸激酶突變體的催化 作用下生產磷酸肌酸，所述肌酸激酶突變體具有如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。
[0006] 上述肌酸激酶突變體可以是未經純化的粗酶形式;也可以是經部分純化或完全純 化的酶，純化過程可采用常規的Histag法;如果需要，還可以是利用固化技術制成的固相酶 或者固相細胞形式的固化酶。
[0007]優選地，所述肌酸與所述三磷酸腺苷的摩爾比為20:1。
[0008] 優選地，所述催化過程還需加入MgCl2和三聚磷酸鈉。
[0009] 優選地，所述催化過程是在pH值為7~8的緩沖溶液中進行。
[0010] 所述緩沖溶液優選為Tr is-HCl緩沖溶液。
[0011] 優選地，所述肌酸激酶突變體為固定在酶固定化載體上的固定化肌酸激酶突變 體。
[0012] 所述酶固定化載體優選為環氧型LX-3000、二氧化硅、活性炭、玻璃珠或者大孔型 聚N-氨乙基丙稀酰胺-聚乙稀。
[0013] 優選地，所述固定化肌酸激酶突變體的加入量為0.01-0.5g/ml緩沖溶液。
[0014] 優選地，所述固定化肌酸激酶突變體的制備方法包括以下步驟：
[0015] ⑴制備洗酶緩沖液：〇.〇2M Tris-HCl和0.001M EDTA的混合溶液，pH值為7.0;
[0016] (2)制備PB溶液:2 · Omol/L磷酸二氫鉀，pH值為7 · 5;
[0017] (3)用步驟（1)制備的洗酶緩沖液將所述肌酸激酶突變體稀釋至5-10mg/ml，并將 得到的酶稀釋液與步驟(2)制備的PB溶液等體積混合，再加入所述酶固定化載體，于搖床中 反應，所述酶固定化載體的加入量為10毫克酶/克載體；
[0018] (4)待步驟(3)反應完全后將所得反應液過濾，并用步驟（1)制備的洗酶緩沖液清 洗，即得固定化肌酸激酶突變體。
[0019]以Oryctolagus cuniculus肌酸激酶親本的基因為模板制備上述肌酸激酶突變體 的方法優選包括以下步驟：
[0020] (l)PCR擴增具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的肌酸激酶親本，擴增引物對 如下
[0021] ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '，
[0022] ckm-R:5'GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3'；
[0023] (2)步驟(1)擴增的產物經限制性內切酶酶切后與載體連接，得質粒A;
[0024] (3)以步驟(2)得到的質粒A為模板，PCR擴增得F-YR片段，擴增引物對如下
[0025] ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '，
[0026] 100YR:5'TTCCTATTATACATCTCTGGCCTTTTTACCTCATA3'；
[0027] (4)以步驟(2)得到的質粒A為模板，PCR擴增得YF-R片段，擴增引物對如下
[0028] 100YF:5'AGAGATGTATAATAGGAAAGAATATTCAGGAAC 3'，
[0029] ckm-R:5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '；
[0030] (5)以步驟(3)得到的F-YR片段以及步驟(4)得到的YF-R片段為模板，PCR擴增得全 長突變體基因 F100Y，擴增引物對如下
[0031] ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '，
[0032] ckm-R：5'GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3'；
[0033] (6)步驟(5)得到的FI 00Y經限制性內切酶酶切后與載體連接，得質粒B;
[0034] (7)將步驟(6)得到的質粒B轉化感受態細菌細胞中，對轉化細菌進行增殖培養并 誘導表達，然后進行細胞破碎處理，提取即得肌酸激酶突變體。
[0035] 本發明提供的上述肌酸激酶突變體的制備方法中，載體優選為pRSET-A。當然，其 還可采用任何適用的其他載體，例如:包括PRSET和pES21在內的原核表達載體、包括pUCl 8/ 19和pBluscript-SK在內的克隆載體等。
[0036] 本發明提供的上述肌酸激酶突變體的制備方法中，所獲得的肌酸激酶突變體基因 可以在原核細胞或真核細胞胞內表達，也可采用本領域已知的任何其它適當方法實現在原 核細胞或真核細胞胞外表達。
[0037] 本發明提供的上述肌酸激酶突變體的制備方法中，載體的宿主細胞可以是包括大 腸桿菌在內的原核細胞，也可以是包括釀酒酵母和畢赤巴斯德酵母在內的真核細胞。
[0038] 有益效果：
[0039] 本發明提供的磷酸肌酸的生物催化生產方法除具備傳統的生物催化方法所共同 具備的反應條件溫和、反應速度快、專一性強及低碳環保等優點之外，還兼具目前現有的磷 酸肌酸的生物催化方法所不具備的產率高、成本低、適于大規模工業化生產的優點。前述后 一部分優點的獲得在本發明中主要來源于以下兩個方面：1、經酶活性測定，本發明人工誘 導獲得的具有如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的肌酸激酶突變體的比活性較肌酸激酶親 本高出111% ;2、經過固定化的肌酸激酶突變體具有更高的活力和更好的穩定性，可提高酶 重復使用率。經試驗證實，本發明提供的生物催化方法使肌酸轉化為磷酸肌酸的轉化率超 過 85 %。
【附圖說明】
[0040] 圖1為肌酸激酶親本與肌酸激酶突變體的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；
[0041] 圖中，從左至右的三條泳道依次為蛋白分子量標準、肌酸激酶親本粗提蛋白（A)、 肌酸激酶突變體粗提蛋白（B)，箭頭所指示為目的酶的位置。
【具體實施方式】
[0042]下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步的詳細說明，以下實施例是對本發 明的解釋，本發明并不局限于以下實施例，實施例中未注明具體條件者，按常規條件或制造 商建議的條件進行。
[0043] 實施例1
[0044]肌酸激酶親本基因的擴增與克隆
[0045] 肌酸激酶親本系指來自Oryctolagus cuniculus的肌酸激酶(CKM)，其核苷酸序列 如SEQIDN0:l所示（參考GenBankNM_001082239)，氨基酸序列如SEQIDN0:2所示（參考 GenBank ΝΡ_00 1075708 )。根據肌酸激酶親本的基因序列設計引物對ckm-F: 5' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT3 ' 和ckm-R: 5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '。用引 物對ckm_F和ckm-R從Oryctolagus cuniculus cDNA文庫中擴增肌酸激酶編碼基因。
[0046] 擴增條件為：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2S〇4,2mM MgS〇4， 0.1%Triton X-100,50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP，400nM引物ckm-F， 400nM引物ckm-R，100ng cDNA，1.0U Pfu DNA聚合酶（Promega，USA)，再用無菌水調反應體 積至50ml。
[0047] PCR擴增反應程序為:95°C3分鐘，35圈循環:95°C50秒、50°C30秒和72°C1分鐘，最 后7 2 °C 10分鐘。擴增的產物經限制性內切酶Nd e I和BamH I酶切后與經同樣限制性內切酶 Ndel和BamHI酶切的載體pRSET-A(源自 Invitrogen，USA)連接，得質粒pRSET-ckm。經DNA測 序，確定該被克隆的肌酸激酶的核苷酸序列，具體示于序列表中