一種通過電化學系統強化微生物菌體利用甘油的方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種通過電化學系統強化微生物菌體利用甘油的方法及其應用，屬于 生物化工技術領域。
【背景技術】
[0002] 在還原型產物合成過程中，當以葡萄糖為唯一碳源時，葡萄糖經糖酵解途徑進行 代謝時產生2分子還原力(NADH)，用于強還原型產物合成的還原力會明顯不足，產物收率降 低;而當以甘油為碳源時，甘油經代謝會產生2分子還原力(NADH)，在此基礎之上，菌株生長 時也會合成一部分NADH，此時，若合成產物的還原性較低，菌體內會積累NADH，此時過剩的 還原力會抑制微生物菌體的生長。
[0003] 為了平衡胞內輔酶代謝，恢復菌體生長的同時保證還原型產物的合成，Claire Vieille等通過引入異源還原性途徑增加 NADH的消耗，同時一些研究過程中采用微厭氧條 件發酵，恢復了產琥珀酸放線桿菌利用甘油代謝生長的能力。但是，微厭氧條件難以控制， 與此同時引入異源代謝途徑會增加菌體代謝負擔，經改造的菌株甘油消耗量也只有l〇g/L 左右，相比以葡萄糖為碳源時，細胞生物量也明顯降低。
[0004] 在燃料電池電化學系統中，菌體通過代謝消耗培養基中的有機物質，碳源或氮源， 代謝過程中產生的電子可以通過某種機制運送到胞外，并進一步傳到陽極電極，通過外電 路最終傳遞至陰極。在此過程中，代謝底物作為電子供體，陽極電極作為電子受體，形成一 個完整的電子傳遞鏈，用于促進胞內代謝、底物利用及電能的產生，如Alfred M. Spormann 等通過電化學系統強化了二氧化碳的利用并加快了電能的產生。
[0005] 但是，不同的代謝物所需的還原力并不相同，因此所需的電化學調控手段也會存 在一定的差異。其中，電子傳遞效率與調控手段的不同有著直接的關系。一般情況下，電化 學活性菌株(如希瓦氏菌)可以合成導電附屬結構(納米導線)或向胞外分泌電子載體(核黃 素）以增加電子的傳遞效率。但是，對于非電化學活性菌株而言，外源電子載體的添加對于 電子在胞內及胞外傳遞過程中起著決定性作用。由于不同的電子載體本身具有的獨特的電 化學特性，即使是同一電子載體，在不同濃度條件下對細胞生長及電子的傳遞作用也并不 一致。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種通過電化學系統強化微生物菌體利用甘油的方法及其 應用，將生物電化學系統(燃料電池系統）引入微生物發酵體系中，用于平衡及調控胞內輔 酶平衡，包括降低胞內還原力水平，平衡還原型底物甘油的消耗及細胞的生長，在此基礎之 上獲得生物電能并增加還原型產物的合成。
[0007] 為了實現本發明的技術目的，本發明采用的技術方案如下： 一種通過電化學系統強化微生物菌體利用甘油的方法，包括菌種活化、種子培養、厭氧 發酵，所述厭氧發酵采用電化學發酵，在發酵培養基中添加電子載體，所述電子載體的濃度 為0.1-1.0臟〇1/1，發酵培養基中甘油濃度為10~4〇8/1。
[0008] 所述菌株為任意可在厭氧條件下生長并可發酵積累還原型產物的菌株，包括但不 限于產琥泊酸放線(Actinobacillus succinogenes)。
[0009] 所述電化學發酵中，選用石墨碳氈作為陰陽兩極電極，Ag/AgCl(飽和KC1)作為參 比電極，發酵培養基和磷酸鹽緩沖液(或鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀溶液)分別作為陰極和陽極 電解液，并通過電子載體介導電子由微生物胞內向電極的傳遞。
[0010] 所述電子載體為具有氧化還原對特性的化合物，可以為化學型電子載體，也可以 選擇可生物型電子載體，包括但不限于中性紅、甲基紫精、硫堇和核黃素。
[0011] 所述電化學發酵中陽極電解液為磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液pH 6-7,濃度0.1- 1.0 111〇1/1，添加氯化鈉(0.1-1.0 111〇1/1)以增加電解液的導電率； 電化學發酵中陽極電解液還可以為鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀溶液，將等量鐵氰化鉀及亞 鐵氰化鉀混合，調PH6-7，濃度控制在0.1-1.0 mol/L。
[0012] 電化學發酵時，陰極室內填充的發酵培養基中包含不同濃度的電子載體，并通過 外電阻將陰陽兩極室聯通。當電子載體為中性紅或核黃素時，濃度為0.1-1.〇 mmol/L;當電 子載體為甲基紫精或硫堇時，濃度為0.1-0.5_〇1/匕更優選地，中性紅11111核黃素11111甲 基紫精 0.5 mmol/L 硫堇0.5 mmol/L。
[0013] 所述電化學系統為采用氣密性良好的微生物電解池裝置，通過外加電子載體的協 助，將胞內代謝產生的過剩電子從胞內傳遞至胞外，進而傳遞至陽極電極以產生電流，在利 用強還原型底物的同時降低胞內還原力以恢復(促進)菌株的生長。所述菌株為產琥珀酸放 線桿菌，厭氧條件下于電化學裝置中發酵時，可以以高還原型底物甘油為碳源進行代謝并 合成還原性產物。
[0014] 所述陽極磷酸鹽緩沖液中添加氯化鈉以增加電解液的導電率，優選為pH 7.0，濃 度0·1-1·0 mol/L。
[0015] 所述發酵培養基既可以為復合培養基，也可以是合成培養基。
[0016] 復合發酵培養基為玉米漿干粉5-10g/L，酵母粉5-15 g/L，乙酸鈉1.0-2.0 g/L， NaCl 0.5-2.0 g/L，CaCl2 0·1-0.5 g/L，MgCl2 0·1-0.5 g/L， NaH2P〇4 1.0-2.0 g/L， Na2HP 〇4 0.1-0.5 g/L，K2HP〇4 1.0-5.0 g/L，碳源甘油，甘油濃度為 10~40 g/L;優選為甘 油 10 g/L，玉米漿干粉7.5 g/L，酵母粉 10 g/L，乙酸鈉 1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L, NaH2P〇4 1.6 g/L, Na2HP 〇4 0.3 g/L, K2HPO4 3 g/L。
[0017] 合成發酵培養基為CH3C00Na 1.0-2.0 g/L, NaCl 0.5-2.0 g/L, MgCl2 0.1-1 ·0 g/L，CaCl2 0·卜1.0 g/L，Na2HP〇4 0· hl.0g/L，NaH2P04l.0-3.0g/L，K2HP04l.0_ 5.0 g/L，NH4HC03 1.0-2.0 g/L，甘油 10~40 g/L，生物素0.01 g/L，煙酸0.025 g/L，蛋氨 酸0.11 g/L;優選為甘油10 g/L，生物素0.01 g/L，煙酸0.025 g/L，蛋氨酸0.11 g/L， CH3C00Na 1.36 g/L，NaCl 1 g/L，MgCh 0.2 g/L，CaCl2 0.2 g/L，Na2HP 〇4 0.31 g/L， NaH2P 〇4 1.6 g/L，K2HPO4 3 g/L，NH4HCO3 1.57 g/L。
[0018] 本發明所述的菌種活化、種子培養步驟是常規的放線桿菌菌種活化方法及種子培 養方法，以產琥泊酸放線桿菌即113(六(：1：；[11(^3(3；[11118 811(^；[110861168 1'0113)為例說明菌種 活化及種子培養步驟:產琥1自酸放線桿菌即113(401：；[11(^30；[11118 81100；[110〖61168 1'0113)菌 株經固體平板培養基活化后，37°C條件下，在厭氧血清瓶中培養12-14小時后轉接于種子培 養基，在37°C，200轉/分鐘的條件下培養6-8小時得到種子液； 將所述種子液按照6%(v/v)的接種量接種于含有所述發酵培養基的H-Cell電化學反應 器中，同時添加不同濃度的電子載體。
[0019] 優選地，所述固體平板培養基和種子培養基的配方為:葡萄糖20 g/L，玉米漿干粉 7.5 g/L，酵母粉 10 g/L，乙酸鈉 1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L， NaH2P〇4 1.6 g/L，Na2HP〇4 0.3 g/L，K2HPO4 3 g/L，瓊脂粉 15-20 g/L。
[0020] 優選地，所述發酵培養基中添加單一電子載體。
[0021] 通過電化學系統強化微生物菌體利用甘油的方法在微生物利用甘油發酵生產還 原型有機酸或者累積電能中的應用。
[0022] 有益效果： 本發明采用微生物電化學調控手段，能明顯增加菌株的生長代謝能力，特別是以甘油 為唯一碳源時菌株生長受限的微生物菌株，例如產琥珀酸放線桿菌菌株NJ1 13 (Actinobacillus succinogenes NJ113)通過電化學系統調控策略，在發酵培養基中能夠 利用甘油生長及代謝，能明顯增加還原型產物的合成。當以甘油為主要碳源時，厭氧條件下 菌株可以利用甘油生長并合成還原型代謝產物:厭氧條件下在復合培養基中添加電子載 體，發酵48小時后，甘油消耗量可達40 g/L，總還原酸累計量達66.96 g/L，在合成培養基中 進行厭氧發酵時，甘油消耗量也可達到10 g/L，有機酸積累量22.07 g/L，兩種發酵模式下 能獲得的最大電壓分別為460 mV和210 mV。證明了在微生物電化學系統的調控下，非電化 學活性微生物菌株可以將胞內過剩的還原力以電子的形式經電子載體傳遞至胞外，降低胞 內還原力水平，恢復細胞的生長能力，同時在此基礎之上，有利于還原型產物的積累及電能 的產生。
【具體實施方式】
[0023] 產琥泊酸放線桿菌NJ113(Actinobacillus succinogenes NJ113)保藏號CGMCC Νο·11716〇
[0024] 本發明中將產琥珀酸放線桿菌NJ113菌株通過固體平板培養基培養后接種至種子 培養基中培養得到種子液;然后將種子液接種到發酵培養基中，并通過電化學調控強化菌 株的代謝性能。
[0025]固體平板培養基和種子培養基的配方為：葡萄糖20 g/L，玉米漿干粉7.5 g/L，酵 母粉 10 g/L，乙酸鈉 1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L, NaH2P〇4 1.6 g/L，Na2HP 〇4 0.3 g/L，K2HP〇4 3 g/L，瓊脂粉 15-20 g/L。
[0026] 產琥珀酸放線桿菌NJ113菌株經固體平板培養基活化后轉接至厭氧血清瓶，37°C， 厭氧條件下培養12-14小時后轉接于種子培養基，在37 °C，200轉/分鐘的條件下培養6-8小 時得到種子液； 將種子液按照6-10 %(v/v)的接種量接種于含有發酵培養基的電化學裝置中，于37°C 進行厭氧發酵。在發酵過程中每隔一段時間進行無菌取樣，對樣品離心處理后測定甘油及 有機酸濃度。
[0027] 根據以下實施例，可以更好的理解本發明。實施案例中所描述的具體的物料配比， 工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本 發明。<