高產2,3-丁二醇的產酸克雷伯氏基因工程菌株的構建方法及其發酵方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種高產2,3_ 丁二醇的基因工程菌株的構建方法及其發酵方法。
【背景技術】
[0002] 產酸克雷伯氏菌(1(1613186113(?71:〇〇3)作為2,3-丁二醇的產生菌，具有適應環境 能力強、底物范圍廣、代謝徹底、副產物較少、產物濃度和轉化率較高等優點被認為是工業 化生產的潛在菌株。但是，酸性副產物乳酸的積累仍是限制2,3_ 丁二醇產量提高的主要因 素，發酵過程中乳酸含量的增加，會抑制菌體的生長，不但降低了 2,3_ 丁二醇的產量，同時 增加了后續對2，3_ 丁二醇分離純化的復雜性。
[0003] 另外，還存在2,3_ 丁二醇轉化率低、生產強度低及純度低的技術問題。
【發明內容】
[0004] 本發明是為了解決目前產酸克雷伯氏菌產2,3_丁二醇產量低、轉化率低、生產強 度低及純度低的問題，提供高產2，3-丁二醇的產酸克雷伯氏基因工程菌株的構建方法及其 發酵方法。
[0005] 本發明高產2,3_ 丁二醇的產酸克雷伯氏基因工程菌株的構建方法，按以下步驟進 行：
[0006] -、敲除ldh基因的產酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01的構建：
[0007] 二、ack基因同源左臂片段ack-L和右臂片段ack-R的構建：
[0008] 以敲除了ldh基因的產酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01基因組DNA為模板，分別 用 ack-Li、ack_L2 和 ack-Ri、ack_R2 引物進行 PCR 反應；
[0009] 三、pack-L 和 pack-R 質粒構建：
[0010]向含有ack基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反應體系中加入0.25yL Taq(5UAx L)DNA聚合酶，72°C水浴中反應lOmin，將目的條帶膠回收純化，獲得片段ack-L和ack-R，將 片段ack-L和ack-R分別與pMD18-T載體連接，獲得克隆載體分別命名為pack-L和pack-R;
[0011] 四、pack-LR質粒構建；
[0012]以pack-L為骨架，選用限制性內切酶Xho I和Bgl II對質粒載體pldh-L進行雙酶 切，選用限制性內切酶Xho I和BamH I對質粒載體pack-R進行雙酶切，用T4DNA連接酶將 pack-R的酶切產物連接到pack-L質粒載體上，得到重組質粒pack-LR;
[0013] 五、pT_Kanr質粒構建：
[0014] 以pET-28a( + )為模板，利用Kan-up和Kan-down為擴增引物，對Kan"進行PCR擴增， 對PCR產物進行TA克隆，得到pT-Karf質粒；
[0015] 六、同源重組片段ackL-Kanr-ackR的構建：
[0016] 以重組質粒pack-LR為骨架，選用限制性內切酶Xho I對重組質粒pT-Kaf和pack-LR進行酶切，將獲得的Karf片段插入質粒載體pack-LR中，構建質粒載體pT-LKR;
[0017] 選擇限制性內切酶Bgl II和BamH I對重組質粒pT-LCR進行酶切，獲得同源重組片 段ackL_Kanr-ackR;
[0018] 七、K.oxytoca HD79_01/pKD46菌株構建：
[0019] 將質粒pKD46電轉化到K.oxytoca HD79-01 感受態細胞，得到K.oxytoca HD79-01/ pKD46菌株；
[0020] 八、同源重組片段ackL_Kanr-ackR轉化K.oxytoca HD79_01/pKD46:
[0021] 將同源重組片段ackL-Karf-ackR電轉化到K.oxytoca HD79-01/pKD46中，得到的 目的菌株為高產2,3_丁二醇的產酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytoca HD79-02。
[0022] 步驟一所述產酸克雷伯氏菌（K.oxytoca)HD79已在文獻《Klebisella oxytoca HD79乙酸激酶部分基因（ack)的克隆與序列分析》（中國農學通報，2015。31(14):83-88)中 公開。
[0023] 上述方法構建的產酸克雷伯氏基因工程菌株的發酵方法，按以下步驟進行：
[0024] 一、將產酸克雷伯氏基因工程菌株K.oxytoca HD79-02的單菌落接種到種子液培 養基中，30 °C，150r/min培養至對數生長期，得種子液；
[0025]二、然后將種子液以5%的接種量接種到裝液量為150mL/500mL的發酵培養基中， 于30°C，150r/min發酵156h后結束；
[0026]步驟一中所述種子液培養基配方：（NH4)2S〇4 lg/L、K2HP〇4 · 3H20 3.4g/L、 KH2P0U · 3g/L、MgS〇4 0 · 2g/L、酵母提取物lg/L、微量元素 2mlVL和鐵溶液lmL/L，調pH值至 7.0,121°C高壓滅菌15min，之后向每100mL種子培養基中加入經108°C高壓滅菌20min的5g 葡萄糖粉末；
[0027]步驟二中所述發酵培養基配方：（NH4)2S〇4 6.6g/L、K2HP〇4 · 3H20 8.7g/L、 KH2P〇46.8g/L、MgS〇4 · 7H20 0.25g/L、酵母提取物5g/L、FeS〇4 · 7H20 0.05g/L、ZnS〇4 · 7H20 0.001g/L、MnS〇4 · 7H20 0.001g/L和CaCl2 · 2H20 0.001g/L，調整溶液的pH值至7.0，121°C 高壓滅菌15min，然后在其中加入經108°C高壓滅菌20min的葡萄糖粉末至濃度為150g/L。
[0028] 本發明的原理：
[0029] 本發明是針對已經敲除了乳酸脫氫酶基因的產酸克雷伯氏基因工程菌株 1(1613丨86113(?71:〇〇3!1079-01，其酸性副產物乙酸的積累仍然限制2,3-丁二醇產量提高的 問題而設計的。ack基因編碼的乙酸激酶是乙酸代謝途徑的關鍵酶，本發明利用XRed同源重 組技術對K.oxytoca HD79-01中ack基因敲除，阻斷乙酸的生成途徑，促使碳流量更多流向 2，3-丁二醇，以期獲得2，3-丁二醇高產菌株。
[0030] 首先，通過PCR技術擴增得到乙酸激酶基因的同源左右兩臂片段，然后將該兩臂片 段連接到卡那霉素抗性基因的左右兩翼，形成一個表達盒ackL-Karf-ackR。將該表達盒轉 入產酸克雷伯氏菌K.oxytoca HD79-01中，通過同源重組的方式，以卡那霉素抗性基因替代 乙酸激酶基因，從而完成對乙酸激酶基因的敲除。獲得突變株由于不能有效的產生乙酸，使 菌株代謝通路發生改變，提高了 2，3-丁二醇的產量。
[0031] 本發明的有益效果：
[0032] 本發明成功敲除產酸克雷伯氏菌(Klebisella oxytoca)HD_79的ldh基因和ack基 因，構建Klebisella oxytocaHD-79-02菌株，減少乙酸和乳酸的產量，提高了2,3-丁二醇的 產量。
[0033] 其中2,3-丁二醇的產量由29.838/1提高到46.218/1，提高了54.9%。而乳酸則由 4 · 94g/L下降到2 · 45g/L，降低了 48 · 2 %。乙酸則由 4 · 28g/L下降到 1 · 59g/L，降低了 62 · 8 % · [0034] 2，3-丁二醇轉化率提高了20 · 5% ; 2，3-丁二醇的生產強度提高了 106 · 5%。另外， 利用該菌株獲得的2，3_丁二醇純度由57.9%增加到71.2%。同時敲除ldh和ack會對菌體的 0D_ nm值降低，但是單一的憑借0D值并不能判斷重組菌株的產2,3-BD的能力，本發明就是為 此提供了一個很好的證明。
[0035] 本發明關于基因敲除高效生產2,3_ 丁二醇的構建研究將為今后基因功能的研究 提供理論依據。
【附圖說明】
[0036] 圖1為ack-L基因和ack-R基因 PCR擴增產物電泳圖；其中Μ為DNA Marker DL2000， 泳道1為ack-L基因 PCR產物，泳道2為ack-R基因 PCR產物；
[0037] 圖2為ack-L基因陽性克隆菌液PCR驗證結果;其中Μ為DNA Marker DL2000,泳道1-5為陽性克隆菌液PCR擴增產物；
[0038] 圖3為ack-R基因陽性克隆菌液PCR驗證結果;其中Μ為DNA Marker DL2000,泳道1-5為陽性克隆菌液PCR擴增產物；
[0039] 圖4為Kan-up、Kan-down引物對的PCR擴增結果;其中Μ為DNA Marker DL2000;泳道 1-2為Karf基因的PCR產物；
[0040] 圖5為Karf基因陽性克隆菌液PCR驗證結果;其中Μ為DNA Marker DL2000,泳道1-5 為陽性克隆菌液PCR擴增產物；
[0041 ]圖6為ack-Li、ack-R2引物對PCR結果；其中Μ為DNA Marker DL2000,泳道 1-2為PCR 產物
[0042]圖7為出發菌株和重組菌株的pH值及0D值對比，其中?表示出發菌株K.oxytoca HD79的0D值，?表示重組菌K.oxytoca HD79-02的0D值，▲表示出發菌株K.oxytoca HD79的 pH值，Λ表示重組菌K · oxytoca HD79-02的pH值；
[0043] 圖8為出發菌株和重組菌株的葡萄糖消耗及2,3_丁二醇產量對比，其中?表示出 發菌株K. oxytoca HD79的葡萄糖消耗，