一種碳納米管固定化漆酶及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及漆酶的固定化領域，具體為一種通過漆酶活性中心與碳納米管連接實 現直接電子傳遞的碳納米管固定化漆酶及其用途。
【背景技術】
[0002] 漆酶(苯二醇:氧化還原酶，EC 1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，和植物中的 抗壞血酸氧化酶、哺乳動物的血漿銅藍蛋白同屬藍色多銅氧化酶家族。漆酶是一種銅蛋白， 一般含4個銅離子，根據光譜和磁性特征可將漆酶中的銅離子分為3類：1型Cu、II型Cu、III 型Cu;其中I型Cu和II型Cu各1個，是單電子受體，呈順磁性，可用電子順磁共振(EPR)測定； III型Cu 2個，是雙電子受體，呈反磁性，EPR檢測不出來。根據X射線、光譜、磁性和實驗事實 推測，銅離子的配位結構為：1型Cu分別被與Cys、Phe的2個S，2個His中的N配位，形成變形的 四面體；II型Cu是三核簇，分別與兩個His中的N和1個0配位，氧化型的漆酶含氧配體可能是 H20或0Η-;ΙΙΙ型Cu的2個Cu分別與3個His中的N配位，又同時與Tyr中的0配位形成氧橋組 成雙核銅區。
[0003] 現有的研究表明銅離子處于漆酶的活性部位，在漆酶的催化氧化過程中起著決定 性作用。漆酶是單電子氧化還原酶，它催化不同類型底物氧化反應機理是一種產生自由基 的單電子反應，主要表現在底物自由基的生成和漆酶分子中四個銅離子的協同作用。漆酶 催化底物氧化反應是通過以下三個主要步驟完成：i) I型Cu從還原型底物接受電子被還原； ii)電子被傳遞到II型Cu和III型Cu形成T2/T3結構域的三核中心；iii)分子氧被激活并在 T2/T3三核結構域被還原成水（Solomon El,Chen P,Metz M,Lee SK,Palmer AE.Oxygen binding，activation，and reduction to water by copper proteins.Angew.Chem.Int.Ed，2001，40:4570-4590)〇
[0004] 漆酶是最具有應用前景的氧化還原酶之一，主要用于有機合成、環境污染物的降 解和染料脫色、生物檢測和電化學分析、造紙工業中的紙漿漂白和廢水處理、纖維原料的降 解等。漆酶在催化過程中消耗氧氣，使得這一過程很容易地被轉化為電信號而高靈敏地得 到檢測，固定化漆酶技術的不斷成熟為漆酶在生物檢測和生物燃料電池中的應用提供了重 要的條件。目前已有報道漆酶電極包括無反應物漆酶電極、雙酶電極等。
[0005] 碳納米管是以碳原子雜化為主，混合雜化所構建成的理想結構，單壁碳納米管是 理想的分子纖維，可看成是片狀石墨烯卷成的圓筒，因此它必然具有石墨級優良的特性，例 如耐熱性、耐腐蝕性、耐熱沖擊性、傳熱和導電性好、高溫強度高、有自潤滑性和生體相容性 等一系列性能。碳納米管的性能優于當前的任何纖維，它既具有碳纖維的固有性質，又具有 金屬材料的導電導熱性，陶瓷材料的耐熱耐蝕性，紡織纖維的柔軟性，以及高分子材料的輕 度易加工性，是一種一材多能以及一材多用的功能材料和結構材料。碳納米管由于其唯一 的結合立體結構、力學性質、電學和化學性質可作為一種優良的電極修飾材料(Bau ghman RH,Zakh i dov A，de He e r WA. Carbon nanotubes - The route toward applications. Science，2002，297: 787-792) D當利用碳納米管對基礎電極表面進行修飾 時，除了可將材料本身的物理化學性質引入電極表面之外，同時也會獲得納米材料的大比 表面積，粒子表面帶有較多的功能基團的特性，從而對某些物質的電化學行為產生特有的 催化效應。碳納米管修飾電極的制備方法有碳納米管糊電極、薄膜修飾電極、溶膠凝膠修飾 電極、自組裝法修飾電極等（Wang J.Carbon-Nanotubes Based Electrochemical Biosensors:AReview.Electroanalysis，2005，17:7-14)〇
[0006] 制約生物檢測電極靈敏度和生物燃料電池輸出功率密的最大因素是電子傳遞過 程。按照Marcus和Sutin提出的理論，電子轉移速率由電勢差、重組能和電子供體與受體之 間的距離決定，理論和實驗均表明，隨著傳遞距離的增加，電子傳遞速率呈指數級下降。因 此，即使將酶固定在電極表面上，僅僅是酶分子蛋白質外殼的厚度就足以對電子由活性中 心到電極的直接傳遞過程產生屏蔽作用。為打破屏蔽，研究者提出借助氧化還原介體，并進 行了大量的研究。雖然介體有效地提供了電子迀移的途徑，但也引入了新的問題，綜合結果 不令人滿意。現在越來越多的研究者試圖尋找一種新的電極材料或制作工藝，實現直接電 子傳遞，借以提高電池功率密度。以酶電極為例，研究者們嘗試的直接電子傳遞的方法主要 有以下幾種：（1)對酶分子的蛋白質外殼進行改造修飾，使得電子得以自由通過，然后把酶 固定在電極上；（2)聚合物固定化酶，導電聚合物就像導線一樣，穿過蛋白質外殼，將電極延 伸到酶活性中心附近，大大縮短電子傳遞的距離，從而實現電子直接傳遞。聚苯胺、聚吡咯、 聚丙烯胺、聚乙烯醇、聚醚酰亞胺、聚亞甲基藍等等先后被各研究者嘗試使用；（3)通過在電 極表面進行貴金屬納米粒子、以及碳納米管等物質的修飾，利用納米粒子獨特的尺寸效應、 表面效應來實現直接、快速的電子傳遞(Demin S,Hall EAH.Breaking the barrier to fast electron transfer.Bioelectrochemistry,2009,76,19-27)〇
[0007] 基于漆酶在生物檢測和生物燃料電池方面的廣闊應用前景，碳納米管已經被研究 者應用于漆酶生物電極和生物燃料電池陰極的相關研究。為了實現直接電子傳遞，Kashyap 等采用碳納米管修飾的電極進行漆酶的固定化，同時與增加了導電聚合物聚苯胺的碳納米 管電極修飾電極進行比較，表明了導電聚合物能夠加速電子傳遞，提高電流密度(Kashyap D,Kim C,Kim SY,Kim YH,KimGM,DwivediPK,SharmaA,Goel S.Multi walled carbon nanotube and polyaniline coated pencil graphite based bio-cathode for enzymatic biofuel cell. International Journal of Hydrogen Energy,2015,40:9515- 9522) ;Guan等采用點擊化學和基因工程的手段通過對酶的修飾實現小漆酶的定向固定化 和直接電子傳遞（Guan DL,Kurra Y,Liu WS,Chen ZL.A click chemistry approach to site-specific immobilization of a small laccase enables efficient direct electron transfer in a biocathode · Chem. Commun · , 2015,51: 2522-2525) ;Aguila等米 用氮摻雜碳納米管固定化漆酶制備電極用于酚類的生物檢測，在一定程度上提高了電極的 靈敏度（Aguila SA, Shimomoto D , Ipinza F, Bedol 1 a-Valdez ZI,Romo-Herrera J, Contreras 0E,Farias MH,Alons〇-Nunez G.A biosensor based on Coriolopsis gallica laccase immobilized on nitrogen-doped multiwalled carbon nanotubes and grapheme oxide for polyphenol detection. Sci. Techno1.Adv.Mater.,2015,16: 055004)。以上研究表明，單一依靠碳納米管提高電子傳遞速率的效果有限；導電聚合物能 夠加速電子傳遞，但帶來了導電聚合物泄漏的風險，增加了成本，綜合效果并不令人滿意； 酶蛋白分子的修飾作用顯著，但過程繁瑣，對于不同來源的漆酶不具有普適性。
【發明內容】
[0008] 本發明要解決的技術問題是克服現有的碳納米管固定化漆酶的技術單一依靠碳 納米管提高電子傳遞速率的效果有限；導電聚合物能夠加速電子傳遞，但帶來了導電聚合 物泄漏的風險，增加了成本，綜合效果并不令人滿意以及對酶蛋白分子的修飾作用顯著，但 過程繁瑣，對于不同來源的漆酶不具有普適性的缺陷，提供一種基于直接電子傳遞的碳納 米管固定化漆酶。
[0009] 為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案：
[0010] 一種碳納米管固定化漆酶，采用以下步驟制備：
[0011] -、碳納米管的表面功能化
[0012] 1 )、將碳納米管進行琥珀酰亞胺基的接枝；
[0013] 2)、將步驟1)得到的琥珀酰亞胺基接枝的碳納米管進行氨基三乙酸功能團的接 枝；
[0014] 3)、將步驟2)得到的碳納米管