一種海洋褐藻酸裂解酶及其表達基因與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種海洋褐藻酸裂解酶及其表達基因與應用，屬于生物技術技術領 域。
【背景技術】
[0002] 我國海域遼闊，海藻資源豐富，是全世界最大的海藻生產國。其中褐藻是開發最多 的種類，占藻類總產量的75%左右。褐藻酸是褐藻中所特有的生物活性多糖，作為天然生物 大分子已被廣泛應用于食品、醫藥、化工等領域。但褐藻酸的分子量大，凝膠性強，在生產加 工、綜合利用等方面受到很大的限制。而其水解后的褐藻寡糖，水溶性好，具有抗菌、抗腫 瘤、免疫調節、降血糖血脂和調節植物生長和防御等多種生物活性，目前已成為國際上褐藻 酸產品深入研發、高附加值利用的代表方向和研究熱點。
[0003] 褐藻寡糖的生產可以采用物理法、化學法和酶解法。但物理法操作復雜，降解條件 難以控制;化學法往往存在目標寡糖的產量低、回收率低和污染環境等問題。而酶解法具有 專一性強、條件溫和、過程可控、得率高等優點，已逐漸成為褐藻寡糖生產最有潛力的生產 方式。作為褐藻寡糖生產的工具酶，褐藻酸裂解酶(alginate lyase)廣泛存在于海洋軟體 動物、棘皮動物和微生物等多種生物，其通過β-消除機制(β-eliminate)裂解褐藻酸單體間 的1-4糖苷鍵，在底物的非還原性末端生成不飽和糖醛酸，從而使得高聚物降解成一系列長 短不一的寡糖鏈。但目前褐藻酸裂解酶的研究基礎薄弱，開發的褐藻酸裂解酶工業酶制劑 很少，褐藻酸裂解酶工業用酶的缺乏成為褐藻與褐藻酸高值化加工的瓶頸。
【發明內容】
[0004] 本發明針對現有技術的不足，提供一種海洋褐藻酸裂解酶及其表達基因與應用。
[0005] -種海洋褐藻酸裂解酶基因 gc，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 上述海洋褐藻酸裂解酶基因 gc編碼的海洋褐藻酸裂解酶GC，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0007] 一種重組表達載體，該表達載體包含有如SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的功能片 段。
[0008] -種重組細胞，該宿主菌中轉化有上述重組表達載體或表達上述海洋褐藻酸裂解 酶GC〇
[0009] 對上述褐藻酸裂解酶GC進行結晶檢測，得到的褐藻酸裂解酶GC的三維結構如下：
[0010] 褐藻酸裂解酶GC晶體結構分辨率2.2A，空間群:P21，晶胞參數：a= 116,_8: A，b = 142,840 A, c= 126.276: Α,α= γ =90°，β=111.09°。褐藻酸裂解酶GC結構在一個晶體 學不對稱單位含有四個蛋白分子，每個蛋白分子分別含有一個氮端和一個碳端結構域，兩 個結構域之間通過一個長達54個氨基酸的linker相連。氮端結構域並碳端結構域分別形成 右手平行β螺旋折疊結構(right-handed parallelP-helix fold)。其中氮端結構域含有1 個α螺旋和39個β折疊，碳端結構域含有1個α螺旋和29個β折疊。GC的催化腔主要位于氮端結 構域，碳端結構域的一個柔性不規則卷曲也參與催化腔的形成。GC的催化中心特異性的結 合有一個鈣離子、一個磷酸根和碳酸根。（如圖7)
[0011] 上述海洋褐藻酸裂解酶GC和/或上述海洋褐藻酸裂解酶基因 gc在褐藻酸裂解中的 應用。
[0012] 褐藻酸裂解酶基因 gc是從Glaciecola chathamensis S18K6T的基因組DNA中克隆 得到的。對具備褐藻酸降解能力的該菌株全基因測序，得到可能編碼褐藻酸裂解酶的基因 gc，褐藻酸裂解酶基因 gc為一個含有2262個核苷酸的開放閱讀框架，該開放閱讀框架共編 碼754個氨基酸。根據信號肽在線預測(http://www.cbs·dtu.dk/services/SignalP/)，該 基因包含84個核苷酸編碼的信號肽。切除信號肽區段，根據其序列設計特異性引物，利用 PCR技術從S18K6%基因組DNA中克隆了編碼褐藻酸裂解酶的基因 gc，構建了含褐藻酸裂解 酶基因 gc的表達載體以及對含有該表達載體的大腸桿菌重組細胞的核酸序列進行了測定。 序列分析表明，褐藻酸裂解酶GC屬于多糖裂解酶第6家族。對純化的褐藻酸裂解酶GC進行性 質測定。結果表明該酶對聚古洛糖醛酸和聚甘露糖醛酸均可降解，為雙功能酶。最適pH為 7.5，，最適酶活溫度為30°C，在40°C內活力較高，對NaCl不耐受。通過對野生型褐藻酸裂解 酶GC及硒代甲硫氨酸的褐藻酸裂解酶GC結晶得到其三維結構。
[0013]有益效果
[0014] 本發明首次獲得了褐藻酸裂解酶GC，并利用結晶的方法得到了褐藻酸裂解酶GC的 晶體并解析了其三維結構。褐藻酸裂解酶GC晶體結構可在工業酶制劑中的底物改造、提高 酶活等方面具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0015] 圖1、通過PCR擴增克隆的編碼褐藻酸裂解酶GC的基因片段的電泳圖
[0016] 圖2、在大腸桿菌中異源表達純化得到的藻酸裂解酶GC電泳圖；
[0017]圖3、褐藻酸裂解酶GC的酶活溫度曲線；
[0018] 圖4、不同濃度的NaCl對極地褐藻酸裂解酶GC酶活性的影響曲線。
[0019] 圖5、褐藻酸裂解酶GC的酶活pH曲線；
[0020] 圖6、褐藻酸裂解酶GC的底物特異性分析；
[0021 ]圖7、褐藻酸裂解酶GC的三維結構飄帶示意圖；
[0022]圖中，金屬離子用球形表示。磷酸根碳酸根均用球棍模型表示，其中前者位于金屬 離子左側，后者位于金屬離子下方。
【具體實施方式】
[0023]下面結合說明書附圖和實施例對本發明做進一步說明，但本發明所保護范圍不限 于此。
[0024] 培養基：
[0025] 分離培養基:0.5wt%蛋白胨、0· lwt%酵母粉、0.5wt%褐藻酸鈉、1.5wt%瓊脂，人 工海水配制，pH 7.0。
[0026] LB液體培養基：lwt %蛋白胨，0 · 5wt %酵母粉，lwt % NaCl，蒸餾水配制。
[0027] LB固體平板：lwt%蛋白胨，0 · 5wt%酵母粉，lwt %NaCl，1 · 5wt%瓊脂，蒸餾水配 制。
[0028] 實施例1:褐藻酸裂解酶GC編碼基因序列的獲取及其序列分析
[0029] 菌種來源：菌株Glaciecola chathamensis S18K6T購自日本微生物菌種保藏中 心，保藏號為13645。
[0030] 具體步驟如下：
[0031] 1.1菌株的篩選
[0032] 取純培養菌株，點種于分離培養基平板上，15°C培養48h，測定菌株的直徑。然后加 入5mL 10wt%西吡氯銨溶液，輕輕旋轉平板使溶液均勻鋪滿整個平皿，靜置lOmin充分染 色，然后用清水沖洗培養基表面去除西吡氯銨溶液，測定透明圈的直徑，并計算透明圈與菌 落的直徑比。
[0033] 1.2褐藻酸裂解酶GC基因序列的確定
[0034]選取固體平板上產生透明降解圈的菌株GC，大量提取其基因組DNA:
[0035] (1 )LB液體培養100ml細菌培養物至飽和狀態，3wt %NaCl溶液洗菌體2次；
[0036] (2)沉淀物加入5ml 3wt%NaCl，用吸管反復吹打使之重懸；
[0037] (3)加入10ml Tris-EDTA緩沖液，輕晃混勻；
[0038] (4)加入溶菌酶，使其終濃度為lmg/ml，37°C作用1~2h;
[0039] (5)加入20wt % SDS和20mg/mL蛋白酶K至終濃度0 · lmg/ml，55°C溫育3h;
[0040] (6)向菌體中加入65°C預熱的CTAB/NaCl溶液4ml，65°C溫育20min;
[00411 (7)加等體積酚/氯仿/異戊醇(體積比25: 24:1)震蕩lOmin后離心，抽提1次，上清 液再用等體積氯仿抽提1次；
[0042] (12)向上清中加入2倍體積預冷的無水乙醇，用玻璃棒將DNA攪絲；
[0043] (13)DNA用體積百分比為70%的乙醇和無水乙醇各洗滌1次，稍干后溶于適量0.1 XSSC緩沖液中，用紫外分光光度計測定DNA濃度及純度后置于4°C冰箱保存(可于-20°c長 期保存）。
[0044] 經全基因測序后通過對其基因注釋，得到可能編碼褐藻酸裂解酶的基因 gc。該基 因含有一個2262bp的開放閱讀框架，其編碼褐藻酸裂解酶GC，起始密碼子位于lbp，終止密 碼子位于2259bp，共編碼754個氨基酸，根據信號肽在線預測，其中包括84個核苷酸編碼的 信號肽區段。獲得的基因 gc的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其編碼的蛋白的氨基酸序列 如SEQ ID N0.2所示。
[0045] 實施例2:褐藻酸裂解酶GC的克隆、異源表達及分離純化 [0046] 2.1利用PCR對gc基因序列進行擴增
[0047] (1)根據信號肽在線預測，該褐藻酸裂解酶基因 gc包括84個核苷酸編碼的信號肽， 切除信號肽，根據基因 gc序列設計兩條特異性引物：
[0048] gcF:GGAATTCCATATGGCTGACTTGCTTGTTAAGACACCA(SEQ ID N0.3)，用下劃線標出的 是Nde頂每切位點；SEQ ID N0.3
[0049] gCR:CCCAAGCTTTTAAAGGACTGTATTGCCGCTTATTG(SEQ ID N0.4)，用下劃線標出的是 HindiΠ 酶切位點；SEQ ID N0.4
[0050] 引物由上海生工生物技術有限公司合成。
[0051 ] (2)以gcF和gcR為引物，以菌株S18K6^DNA為模板，用FastPfu DNA聚合酶（購自 Transgen公司）擴增目的基因片段；
[0052] PCR反應條件為：95°C預變性2min;然后95°C變性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸 9〇8,30個循環后；72°(：延伸1〇11^11;
[0053] (3)對PCR擴增產物進行lwt %瓊脂糖凝膠電泳，結果表明獲得一條約2200bp的DNA 片段(如圖1);然后用Omega公司的DNA回收試劑盒按照其說明回收擴增DNA片段；
[0054] (4)用限制性內切酶Ndel和Hindlll對回收片段和質粒pET22b分別進行雙酶切反 應。酶切結束后，對酶切產物進行lwt%瓊脂糖凝膠電泳