一種iNKT淋巴細胞的擴增激活方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于免疫學領域，具體是指使用轉染了多種蛋白質的宿主細胞，聯合多種蛋白共同作用定向擴增激活iNKT細胞的方法。
【背景技術】
[0002]iNKT細胞治療對多種腫瘤例如:肺癌、頭部和頸部鱗狀細胞癌、肉瘤癌和急性白血病等腫瘤治療有明顯療效。目前iNKT細胞治療在美國主要用來和手術、化療和放療聯合使用解決腫瘤的復發問題。iNKT細胞數量和殺傷功能與療效直接相關，治療中存在的問題在于獲得大量高純度的iNKT細胞非常困難。傳統使用的白介素2聯合α-半乳糖神經酰胺擴增生長的倍數有限(平均100倍)；純度低(20 %-30 % );擴增后的iNKT細胞殺傷功能低下，不能滿足臨床需求。本發明人之前的發明采用轉染⑶8α-白介素21、CD14、⑶19、CD86、⑶163和CD137L蛋白質的K562細胞(以下簡稱宿主細胞)用于擴增NK細胞。本發明將宿主細胞結合傳統使用的α-半乳糖神經酰胺和白介素2定向擴增激活iNKT細胞，解決了 iNKT數量和純度的問題，能夠充分滿足臨床治療的需求。
【發明內容】
[0003]本發明針對現有技術中的不足，提出一種更加有效的iNKT淋巴細胞的擴增激活方法。
[0004]本發明是通過下述技術方案得以實現的:一種iNKT淋巴細胞的擴增激活方法，使用轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞，聯合蛋白質Α1、α_半乳糖神經酰胺共同對淋巴細胞進行擴增激活，得到iNKT淋巴細胞;所述蛋白質A包含CD8a的完整片段和白介素21的功能片段；蛋白質B包含CD14的功能片段；蛋白質C包含CD19的功能片段;蛋白質D包含CD86的功能片段;蛋白質E包含CD163的功能片段;蛋白質F包含CD137L的功能片段;蛋白質Al包含白介素2的功能片段。
[0005]進一步地，所述宿主細胞為K562細胞。
[0006]進一步地，所述的蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的劑量均為50pM-1000pM。蛋白質Al和a-半乳糖神經酰胺的劑量在1-100納克/毫升。所述宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞=1-10:1，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞= 1-4:1，最優選地為1:1。
[0007]進一步地，所述蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F為純化的蛋白質或由宿主細胞在細胞膜表面即時表達，蛋白質Al為純化的蛋白質；所述純化是指質量分數在90%以上。
[0008]進一步地，所述蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F分別為CD8a_白介素21復合物、CD14、CD19、CD86、CD163和CD137L，其中，CD8a為在宿主細胞膜上表達的膜蛋白，⑶8a連接白介素21后使得白介素21表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；CD14、⑶19、CD86和CD137L均為膜蛋白。[0009 ] 進一步地，所述淋巴細胞選自外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、i NKT細胞中的一種或多種，或者為外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、iNKT細胞中的一種或多種和其它淋巴細胞的組合，或為白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、CD163、⑶137L、白介素2中的一種或多種按照任意比組成的混合物作用于人體血管中的血液所產生的淋巴細胞。
[0010]進一步地，轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞通過蛋白穩定表達系統得到。
[0011]進一步地，所述方法包括:
[0012](I)對轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞進行致死處理;所述致死處理選自強酸、強堿、輻照(劑量為100Gy-1000Gy)。
[0013](2)在含有淋巴細胞的培養液中，加入步驟I處理后的宿主細胞、以及蛋白質Α1、α-半乳糖神經酰胺共同培養7天;使得所述的蛋白質Α、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質Ε、蛋白質F的量均為50ρΜ-1000ρΜ。蛋白質Al和α-半乳糖神經酰胺的劑量在1-100納克/毫升。所述宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞=1-10:1，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞= 1-4:1，最優選地為1:1。
[0014](3)經培養后，輻照后的宿主細胞破裂，將培養后的培養液離心，獲取存活的淋巴細胞沉淀，并用培養液重懸；
[0015](4)加入輻照處理后的宿主細胞，使得宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞=1-10: I，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞=1-4: I，最優選地為I: I培養7天;經培養后，輻照后的宿主細胞破裂，將培養后的培養液離心，獲取存活的淋巴細胞沉淀，即得到iNKT淋巴細胞；
[0016]其中，所述培養液由100體積的1640培養液和10體積的胎牛血清組成。
[0017]一種iNKT淋巴細胞的應用，其特征在于，所述應用為，將iNKT淋巴細胞用于制備治療癌癥、傳染性疾病、糖尿病、或器官移植的藥物。
[0018]本發明的有益效果在于:
[0019](I)本發明在轉染⑶8α-白介素21功能片段和⑶137L功能片段的K562細胞的基礎上，轉染了⑶14功能片段、CD19功能片段、CD86功能片段、CD163功能片段。Κ562細胞上轉染的CD14功能片段、CD86功能片段、CD163功能片段有助于激活iNKT細胞識別并殺傷微環境中M2類型的腫瘤相關巨噬細胞;轉染CD19功能片段有助于激活iNKT細胞識別并殺傷B細胞。
[0020](2)本發明提供體外擴增和激活iNKT的方法比傳統的用α-半乳糖神經酰胺和白介素2擴增和激活iNKT細胞的方法，擴增的數量提高22倍;擴增后PBMC中的iNKT細胞的純度從I %提高到98.5%。動物實驗結果表明:與用傳統的方案擴增的iNKT細胞相比，采用本發明擴增的iNKT細胞顯著提高了對小鼠體內腫瘤的殺傷能力。
[0021](3)本發明通過宿主細胞;α-半乳糖神經酰胺和白介素2功能片段培養擴增激活的iNKT提高病人的免疫力來幫助病人抵抗腫瘤，抵抗病毒和細菌。
【附圖說明】
[0022]圖1.1NKT細胞體外擴增線性圖，顯示iNKT淋巴細胞在本發明通過宿主細胞;α-半乳糖神經酰胺和和白介素2共同作用下線性增長。α-半乳糖神經酰胺和和白介素2擴增iNKT細胞作為對照；
[0023]圖2.PBMC中iNKT細胞體外擴增線性圖，顯示iNKT細胞在宿主細胞;α-半乳糖神經酰胺和白介素2共同作用下線性增長。α-半乳糖神經酰胺和和白介素2擴增PBMC中的iNKT細胞作為對照；
[0024]圖3.PBMC中iNKT細胞體外擴增流式細胞儀數據圖，PBMC細胞在宿主細胞;α-半乳糖神經酰胺和和白介素2共同作用下培養14天和21天后iNKT細胞(⑶3+/Va24_Jal8)的比例顯著增長。a-半乳糖神經酰胺和和白介素2擴增iNKT細胞作為對照；
[0025]圖4.1NKT細胞殺傷腫瘤細胞圖，PBMC細胞在宿主細胞;a-半乳糖神經酰胺和和白介素2共同作用培養14天后，丨爾1'細胞對1(562、？03^549、他?62腫瘤細胞的殺傷作用。€[-半乳糖神經酰胺和和白介素2擴增PBMC中iNKT細胞作為對照；
[0026]圖5.1NKT細胞殺傷TAMs細胞，I3BMC細胞在宿主細胞;a-半乳糖神經酰胺和和白介素2共同作用培養14天后，iNKT細