一種生產3-羥基丙酸的重組大腸桿菌及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種3-羥基丙酸的制備方法，特別涉及一種生產3-羥基丙酸的重組大 腸桿菌及其制備方法和應用。 (二)
【背景技術】
[0002] 由于煤炭石油等不可再生資源日益減少，潛力巨大的燃油生物煉制技術受到越來 越多的關注，其中，生物柴油產業更是在近幾年內迅速發展。然而，每生產10噸生物柴油就 會產生1噸甘油。甘油的生產增長迅速，致使甘油價格一路走低。充分利用來源豐富、價格低 廉的甘油，可以帶來巨大的經濟效益和環境效益。
[0003] 3-羥基丙酸(3-HP，C3H603)與乳酸為同分異構體，是一種重要的平臺化合物，它無 色、無味，可以與水、醇、醚等多種溶劑互溶。由于具有羥基和羧基兩個活性基團，因而在化 學反應中是多種化工原料的合成前體，也是構成很多高分子的單體，例如3-HP能夠脫水生 成丙烯酸，氧化即成丙二酸，還原生成1，3_丙二醇，而這些都是重要的化工和日用品原料。 由于3-HP顯著的市場價值及工業應用前景，2004年美國能源部報告將3-HP列為當今世界上 12種最具有開發潛力的化工產品之一。
[0004] 目前，3-羥基丙酸的生產方法是化學合成法，主要有水合丙烯酸法和β-丙烯氰轉 化法。但在碳末端引入功能團有很大的難度，且其產品不易分離提純，生產成本較高，生產 過程存在不安全因素，而微生物發酵方法生產3-ΗΡ可以有效的避免這些不利因素。相比化 學合成法，生物合成具有操作簡便、條件溫和、綠色環保的優點，因而越來越多的科研工作 者將研究重點放在了生物合成途徑上。
[0005] 微生物產3-ΗΡ早在上世紀60年代就有報道，但是天然存在的菌株所需底物價格高 且3-ΗΡ產率都比較低，因此長期處于實驗室階段。近年來，隨著分子生物學技術的發展，大 量研究開始集中于對天然菌株進行途徑改造，利用重組菌以甘油或葡萄糖等廉價碳源為底 物生產3-ΗΡ。基因工程菌的構建按照底物的不同主要分為以葡萄糖為底物和以甘油底物兩 種。葡萄糖為底物的轉化路線以美國Cargill公司的研究最為成熟，該公司構建了多條從葡 萄糖到3-HP的路徑，其中最具有代表性的過程為:葡萄糖經酵解途徑到丙酮酸，丙酮酸還原 生成乳酸，乳酸在丙酰輔酶A轉移酶的作用下生成乳酰輔酶A，后者在乳酰輔酶A脫水酶作用 下生成丙酰輔酶A，進而在3-羥基丙酰脫水酶的作用下，生成3-羥基丙酰輔酶A，最終生成3-HP〇
[0006] 以甘油為底物生成3-ΗΡ通常有兩步反應組成:甘油先在甘油脫水酶及輔酶維生素 Β12的作用下脫水生成3-羥基丙醛(3-ΗΡΑ)，然后3-ΗΡΑ經醛脫氫酶脫氫生成3-ΗΡ，在此過程 需要輔酶NAD+。同以葡萄糖為底物的路徑相比，甘油到3-ΗΡ生成途徑短，構建和調控更加簡 單有效。
[0007] 迄今為止，構建基因工程菌制備3-ΗΡ的研究取得了一定的進展，但是還存在諸多 問題:⑴途徑改造本身需要繁瑣的分子生物學操作，后期培養往往還需要額外加入抗生素 和誘導劑等，增加操作難度，提高了生產成本;⑵以大腸桿菌為宿主，3-ΗΡ產量相對較高，但 其自身不具有甘油脫水酶酶活，構建過程復雜，并且大腸桿菌自身不能生成甘油脫水酶的 輔酶維生素 B12，需要在發酵體系中額外加入，因其價格昂貴，從而使發酵成本大增;⑶代謝 過程中會產生各種副產物，分離純化困難;⑷重組菌中甘油脫水酶和醛脫氫酶的活性平衡 問題也影響了 3-HP產量的提高；(5)生成3-HP的過程中，醛脫氫酶的輔因子不能及時生成也 是制約3-HP產量的重要原因。 (三)
【發明內容】
[0008] 本發明目的是針對現有問題，提供了一株敲除菌，用于解除甘油進出細胞的抑制， 同時再生醛脫氫酶的輔因子NAD+，從而提高3-HP產量。
[0009] 本發明采用的技術方案是：
[0010] 本發明提供一種生產3-羥基丙酸的重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌是將甘油脫 水酶基因 dhaB123、甘油脫水酶再激活因子基因 gdrA(甘油脫水酶基因 dhaB123和甘油脫水 酶再激活因子基因 gdrA的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示）、α-酮戊二酸半醛脫氫酶突變體 編碼基因 TUkgsadh(核苷酸序列為SEQ ID如.3所示）和甘油三磷酸脫氫酶編碼基因8?(11 (核苷酸序列為SEQ ID N0.4所示）導入宿主菌中構建而成;所述宿主菌為敲除甘油抑制因 子基因 glpR(Gene ID:947926)的大腸桿菌（即E.coli W3110_A glpR)，所述α-酮戊二酸半 醛脫氫酶突變體是將α-酮戊二酸半醛脫氫酶(編碼基因 kgsadh核苷酸序列為SEQ ID NO. 2 所示)的120位谷氨酸突變為天冬氨酸，219位脯氨酸突變為丙氨酸獲得的。
[0011] 進一步，所述甘油脫水酶基因 dhaB123和甘油脫水酶再激活因子基因 gdrA通過重 組質粒pACYCDuet-tac-dhaBl 23-gdrA導入宿主菌中。
[0012] 進一步，所述α-酮戊二酸半醛脫氫酶突變體基因 TUkgsadh通過重組質粒 pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh 導入宿主菌中。
[0013] 進一步，所述甘油三磷酸脫氫酶編碼基因 gpdl通過重組質粒pCDFDuet-tac-gpdl- TUkgsadh導入宿主菌中。
[0014] 進一步，所述大腸桿菌為E.coli W3110。
[0015] 本發明還提供一種所述生產3-羥基丙酸的重組大腸桿菌在合成3-羥基丙酸中的 應用，具體所述的應用：將重組大腸桿菌接種至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸鏈霉素的發 酵培養基中（以甘油為底物），在37°C、150rpm條件下振蕩培養至OD600達到0.4~0.8時，向發 酵液中加入終濃度0.01~0.5mM的IPTG，同時加入終濃度5g/L的VB 12，在28 °C、150rpm條件下 誘導發酵，發酵結束，獲得含3-羥基丙酸的發酵液;所述發酵培養基濃度組成為:甘油10-30g/L(優選30g/L)，NaCl lg/L，MgS〇4.7H20 0.25g/L，Na2HP〇4.12H20 22.7g/L，KH2P〇43g/ L，酵母膏4g/L，（NH4)2S〇43.2g/L，溶劑為去離子水，pH值為7.00。
[0016] 進一步，優選所述IPTG終濃度為0.0 lmM。
[0017] 進一步，所述重組大腸桿菌在發酵培養前先進行斜面活化和種子培養，所述斜面 活化為:將重組大腸桿菌接種至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸鏈霉素的LB固體培養基，在 37°C培養16h，獲得活化后的重組大腸桿菌;所述種子培養為:將活化后的重組大腸桿菌接 種至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸鏈霉素的LB液體培養基，在37°C培養10h，獲得種子液。 所述種子液按體積濃度6 %的接種量接種至發酵培養基。
[0018] 本發明所述甘油脫水酶基因 dhaB123及甘油脫水酶再激活因子基因 gdrA來自克雷 伯氏菌Klebsiella pneumoniae DSM 2026。本發明所使用的α-酮戊二酸半醛脫氫酶 (KGSADH)來自巴西固氮螺菌A.brasilense。本發明所使用的甘油三磷酸脫氫酶基因 gpdl來 自釀酒酵母S. cerevisiae。
[0019] 本發明不僅克隆了來自K.penumoniae DSM 2026的甘油脫水酶基因 dhaB123及甘 油脫水酶激活因子基因 gdrA構建重組質粒pACY⑶uet-tac_dhaB123-gdrA，而且還克隆了 A.brasilense的α-酮戊二酸半醛脫氫酶基因 kgsadh篩選突變體編碼基因 TUkgsadh與來自 釀酒酵母的甘油三磷酸脫氫酶編碼基因 gpdl構建了重組質粒pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh。
[0020] 本發明所述宿主E.coli W3110,是敲除了控制甘油進出細胞的甘油抑制因子 GlpR，達到加大甘油輸入細胞的量，從而加大甘油的代謝，從而提高目的產物3-羥基丙酸的 產量。本發明通過將重組質粒口40￥0〇1161：-七&(3-(111&13123-8(1^和口00?〇1161：-七&(3-8口(11-TUkgsadh導入到E · coli W3110_ Δ glpR中實現3-HP的生產。
[0021] 本發明所述缺失基因的方法采取Red系統同源重組，在本領域技術人員的能力范 圍之內。所述重組載體導入重組宿主菌的方法采用化學轉化法。
[0022]本發明以大腸桿菌E.coli W3110_AglpR為宿主菌，在合成產物時需要添加適量 的維生素也2;敲除了宿主菌中抑制甘油代謝的相關基因，提高了甘油進入細胞的效率。
[0023] 與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在:通過利用基因敲除技術解除甘油 進出細胞的抑制，同時再生醛脫氫酶的輔因子NAD+，從而提高3-HP產量，提高了 12倍。 (四）【附圖說明】
[0024] 圖1.利用甘油合成3-羥基丙酸的代謝途徑示意圖；
[0025] 圖2 ·重組質粒 pACYCDuet-tac_dhaB123-gdrA 構建不意圖；
[0026] 圖3 ·重組質粒pCDFDuet-tac-TUkgsadh構建不意圖；
[0027] 圖4.重組質粒 pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh 構建不意圖；
[0028] 圖5.甘油在大腸桿菌中的代謝途徑；
[0029]圖6. IPTG誘導濃度對重組大腸桿菌中蛋白表達量的影響示意圖；（Maker表示標準 蛋白分子量，泳道 1 的菌株為E.coli W3110_A glpR(pACYCDuet-tac_dhaB123-gdrA/ pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh)，0 · 5mM IPTG誘導；泳道2 ~5為菌株E.coli W3110 (pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac_TUkgsadh)，IPTG誘導濃度依次為0、 0·01mM、0 · 25mM及0 · 5mM，泳道6~9為菌株E. coli W3110_Δ glpR(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh)，IPTG誘導濃度依次為0、0 · 01mM、0 · 25mM及0 · 5mM，箭 頭指示目的蛋白。）
[0030]圖7.重組大腸桿菌發酵合成3-羥基丙酸的高效液相色譜圖；（A~D為標準品，E、F 為E · coli W3110(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac_TUkgsadh)發酵產物的不 差檢測圖和紫外檢測圖，G、H為 E.coli W3110_A glpR(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/