一種抗錦鯉免疫球蛋白IgM的單克隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種抗錦鯉免疫球蛋白IgM的單克隆抗體及 其應用。
【背景技術】
[0002] 錦鯉作為觀賞魚的一個大類，體型優美、色彩艷麗，在國內已大量養殖，是目前休 閑漁業的主要品種。隨著養殖環境越來越惡劣，錦鯉的各種傳染性疾病例如鯉春病毒血癥、 皰疹病毒性乳頭瘤、錦鯉皰疹病毒病等開始廣泛傳播，亟需各種疫病檢測方法的建立，而抗 錦鯉免疫球蛋白IgM單克隆抗體的成功制備將為錦鯉各種疫病的免疫學診斷提供重要材 料。
[0003] 抗體是脊椎動物的免疫系統在抗原的刺激下，由淋巴細胞所產生的可與相應的抗 原發生特異性結合的免疫球蛋白，哺乳動物中已經報道的免疫球蛋白包括:免疫球蛋白Μ (IgM)，免疫球蛋白D(IgD)，免疫球蛋白A(IgA)，免疫球蛋白E(IgE)和免疫球蛋白G(IgG)，魚 類雖然是低等的脊椎動物，但是其免疫系統同樣可以產生不同類型的免疫球蛋白，硬骨魚 類中已經報道的免疫球蛋白包括IgM、IgD、IgZ和IgT，IgM是一類存在于所有有頌類脊椎動 物中的抗體。
[0004] 當前，對于錦鯉皰疹病毒的檢測，最為常用的方法是基于PCR擴增技術的各種分子 生物學檢測方法，具有較高的敏感性和特異性。但這些分子生物學方法都是檢測病毒的核 酸存在與否，方法單一，經常導致假陽性和假陰性結果，難于對該病做到定量檢測與確診。 因此，急需其它方法來彌補分子生物學檢測方法的不足，如各種免疫學(血清學)檢測方法。
【發明內容】
[0005] 本發明的一個目的在于提供一株雜交瘤細胞株A5-E10,已于2016年1月14日保藏 于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:C2015218。
[0006] 本發明的另一個目的是提供一種由上述保藏編號為CCTCC N0:C2015218的雜交瘤 細胞株分泌產生的抗錦鯉免疫球蛋白IgM單克隆抗體。
[0007] 本發明的另一個目的是提供一種錦鯉皰疹病毒間接ELISA檢測方法。
[0008] 本發明所采取的技術方案是： 一種抗錦鯉免疫球蛋白IgM的單克隆抗體，其可特異性識別錦鯉免疫球蛋白IgM，效價 高于1:10000。所述單克隆抗體由保藏編號為CCTCC NO:C2015218的雜交瘤細胞株分泌產 生。
[0009] 一株雜交瘤細胞株，已于2016年1月14日保藏于中國典型培養物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE C0LLECTI0N，CCTCC)，保藏編號為CCTCC N0:C2015218,保藏地 址為：中國，武漢，武漢大學。
[0010] 上述的單克隆抗體在制備用于檢測錦鯉免疫球蛋白IgM的免疫檢測工具中的應 用。
[0011] 上述的單克隆抗體在制備用于檢測錦鯉皰疹病毒的免疫檢測工具中的應用。
[0012] 所述免疫檢測工具包括試劑、試劑盒、芯片或試紙。
[0013] 一種錦鯉皰疹病毒間接ELISA檢測試劑盒，其包括上述的抗錦鯉免疫球蛋白IgM的 單克隆抗體。
[0014] 所述試劑盒中還包括:包被液、標準血清、洗滌液、HRP標記羊抗鼠抗體、TMB顯色液 和終止液。
[0015] 一種錦鯉皰疹病毒間接ELISA檢測方法，包括如下步驟： (1) 加樣:將待檢樣品加入包被有KHV病毒的酶標板中； (2) 溫育：用封板膜封板后置36~38°C溫箱中孵育 (3) 洗滌:將樣品從每個孔中吸出，用PBST洗滌； (4) 加入鼠抗錦鯉IgM抗體:將稀釋好的抗錦鯉免疫球蛋白IgM的單克隆抗體加入上述 步驟(3)洗滌好的酶標板中； (5) 溫育、洗滌，同步驟(2)和(3); (6) 加入二抗:將稀釋好的HRP標記羊抗鼠抗體加入上述步驟(5)中洗滌好的酶標板中； (7) 溫育、洗滌，同步驟(2)和(3); (8) 顯色:往反應孔中加入TMB顯色劑，36~38°C避光顯色； (9) 測定及結果判斷。
[0016] 本發明的有益效果是： 本發明的雜交瘤細胞株及所分泌的抗錦鯉IgM單克隆抗體具有以下優點： 1) 本發明的雜交瘤細胞株由SP2/0細胞骨髓瘤細胞與免疫了錦鯉免疫球蛋白IGM的小 鼠脾細胞融合而獲得； 2) 該雜交瘤細胞株能夠無限增殖并持續產生抗錦鯉免疫球蛋白IGM單克隆抗體； 3) 本發明的抗錦鯉免疫球蛋白IGM單克隆抗體可以特異性識別錦鯉免疫球蛋白IGM; 4) 本發明的抗錦鯉免疫球蛋白IGM單克隆抗體特異性強效價高。
【附圖說明】
[0017] 圖1為純化的錦鯉免疫球蛋白的SDS-PAGE膠檢測圖（1為Marker，2為錦鯉IgM)。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0019] 實施例1抗錦鯉免疫球蛋白IGM單克隆抗體的制備和純化 材料與方法 實驗材料 試驗錦鯉來源于中國水產科學研究院珠江水產研究所，體長20cm;其他化學試劑為分 析純，由國藥集團化學試劑有限公司提供。
[0020] 1錦鯉IgM純化 1.1斷尾采取錦鯉血液，置于玻璃管中，于室溫下凝固，先于37°C下放置2h，再于4°C放 置過夜，待血清充分析出后，3000g/min離心10min,取其上清。
[0021] 1.2純化:將魚血清12000rpm離心20 min，取上清;對上清液測量體積;邊攪拌邊慢 慢加入飽和硫酸銨溶液到上清液中，至最終飽和度為33%;將溶液放在磁力攪拌器上攪拌過 夜(4°C)，使蛋白質充分沉淀;蛋白質溶液10000 rpm離心30min(4°C)，將上清移至干凈管 中，沉淀用適量的1XTOS溶解，放入透析袋(8000-14000kd)在1XPBS透析24-48小時(4°C)， 每隔3-6小時換透析緩沖液一次，以徹底除去硫酸銨;透析后溶液5000rpm離心10min，上 清轉到干凈管中，并取小樣備用;在之前的硫酸銨沉淀離心上清溶液中，繼續緩慢添加飽和 硫酸銨至飽和度為50%;將溶液放在磁力攪拌器上攪拌過夜(4°C)，使蛋白質充分沉淀;蛋白 質溶液10000 rpm離心30min(4°C)，將上清移至干凈管中，沉淀備用；將沉淀溶于少量 1XPBS中，沉淀溶解后放入透析袋在lXroS透析24-48小時(4°C)，每隔3-6小時換透析緩 沖液一次，以徹底除去硫酸銨;透析之后的溶液5000rpm離心10min，取上清轉到干凈管中， 并取小樣備用;對兩次飽和度的留取小樣進行電泳檢測;之后將50%硫酸銨沉淀的透析上清 過Protein A柱進行純化(通過填料和上清混合后于搖床上搖晃反應4h)。
[0022] 1.3純化后IgM的檢測:通過SDS-PAGE電泳檢測血清中IgM的純化效果，樣品與等體 積樣品緩沖液混合后后，100°C沸水水浴3-5min，經離心后上樣。分離膠濃度為12%，電泳電 壓為100V，電泳時間為lh，電泳后用考馬斯亮藍染色。
[0023] 檢測結果表明，經Protein A親和層析柱純化的樣品進行SDS-PAGE檢測，得到大小 約為75kD與25kD的兩條帶，與預期的錦鯉IgM重鏈和輕鏈分子量相近。
[0024] 2動物免疫 以上述純化的錦鯉IgM為特異性抗原免疫6周齡BALB/c小鼠，取6只6周齡雌性BALB/c小 鼠皮下注射抗原，第一次免疫將抗原與等量弗氏完全佐劑乳化，l〇〇ug /只；兩周后進行第 二次免疫，抗原與等量弗氏不完全佐劑乳化，皮下注射，50ug /只；兩周后進行第三次免疫， 免疫方法及劑量同第二次免疫。第三次免疫一周后，小鼠斷尾采血測其效價，第三次免疫兩 周后，選擇效價最高的小鼠，用不加佐劑的抗原加強免疫，3 d后取小鼠脾細胞與SP2/0細胞 融合。
[0025] 3小鼠融合 3.1小鼠骨髓瘤細胞與脾細胞融合 將生長狀態良好的SP2/0細胞，吹打下來后，lOOOrpm離心5min;棄去上清，用20-40ml預 熱的1640培養液重懸，lOOOrpm離心5min;重復上述步驟;棄去上清，加入適量預熱的1640培 養液重懸沉淀;取50ul細胞懸液與150ul臺盼藍混勻后，于顯微鏡下檢活計數;每個融合取1 X107個細胞，與處理好的1X108個脾細胞在進口的50ml離心管中混合均勻后，1350rpm離心 7min;用抽液栗抽干上清;有節奏的在超凈臺桌面上敲打離心管底部，使沉淀松動呈糜狀； 沿著離心管底部的管壁，緩慢加入lml預熱的PEG，并用槍頭順時針方向攪拌，同時離心管保 持逆時針方向轉動。該步驟需在60-90s內完成;將離心管靜置30-60s;沿管壁緩慢滴加5ml 預熱的1640培養液，再逐漸加快速度，加入15ml預熱的1640培養液，再加入20ml SP2/0骨髓 瘤細胞培養液；1200rpm離心5min;棄去上清，將細胞重懸至100ml預熱的含15% FBS 1*HAT 的1640細胞培養液中，100ul/孔的量將混合細胞懸液鋪到96孔細胞培養板上。然后將培養 板置37°C 5% C02培養箱內培養;5 d后用新鮮的HAT培養基換出一半培養基；10 d后用預熱 的HT換出HAT;觀察雜交瘤細胞的生長情況，待其細胞培養上清變黃或克隆分布至孔底面積 的1/10以上時，吸取適量細胞上清進行ELISA檢測，兩次檢測結果為陽性設為陽性克隆孔。 [0026] 3·2多克隆細胞株的ELSIA檢測 包板：用Coating buffer稀釋抗原至lug/ml，以50ul/孔的量鋪到酶標板上，輕輕振搖 使包被液鋪滿孔底，4°C包被過夜;次日棄去包被液，用TOST以200ul/孔洗1遍，在吸水紙上 拍干； 封閉：以60ul/孔加入1% BSA，37°C封閉lh; 一抗(加樣）:將稀釋好的樣品以50ul/孔加入到酶標板上，同時設置好陽性對照與陰性 對照(對照組需做復孔），37°C作用lh;用PBST以200ul/孔清洗2遍； 二抗：用1%BSA稀釋HRP標記的羊抗鼠二抗，1:10000稀釋，以50ul/孔