一種誘導蛇足石杉離體葉狀體高產石杉堿甲的方法
【技術領域】
[0002]本發明涉及一種誘導蛇足石杉離體葉狀體高產石杉堿甲的方法，即離體誘導和篩 選高產石杉堿甲的蛇足石杉葉狀體株系的方法，屬于植物生物技術領域。
【背景技術】
[0003]蛇足石杉Huperzia serrata (Thunb.ex Murray) Trev.，又名千層塔、蛇足石松、 蛇足草等，為石杉科石杉屬蕨類植物，全草入藥。自1972年國內首次報道該植物中的生物 堿-石杉堿甲（hupenine A，Hup-A)具有橫紋肌松馳作用，以后深入研究發現該生物堿是 一種強效、可逆和高選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑。在低劑量Hup-A下對乙酰膽堿酯酶(Ach E)有強大的抑制作用，使分布區內神經突觸間隙的乙酰膽堿(Ach)含量明顯升高，從而增強 神經元興奮傳導，強化學習與記憶腦區的興奮作用，起到提高認知功能、增強記憶保持和促 進記憶再現的作用，它是目前國內最為成功的治療阿爾茨海默病(老年性癡呆癥）的藥物。 隨著老年化社會到來，阿爾茨海默病(老年性癡呆癥）已成為人類的第四大病魔，蛇足石杉 是我國特有植物，由于蛇足石杉等石杉科植物生長于深山密林，生境條件特殊，很難解決石 杉科植物大面積的人工栽培。近年來人們大量挖采掠奪野生資源，直接導致國際市場上 Hup-A的供應缺口加大，自然千層塔資源匱乏凸顯。
[0004] 自2012年本專利發明人離體培養蛇足石杉葉狀體成功以來，深入廣泛開展研究， 發明了"一種產石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導和增殖的培養方法"和"一種產石杉堿 甲的激素自養型蛇足石杉離體葉狀體克隆系"，利用上述專利技術又發明了"一種誘導蛇足 石杉離體葉狀體高產石杉堿甲的方法"，利用本項發明轉化生產應用可獲得大量的蛇足石 杉葉狀體高產石杉堿甲藥物的植物資源，將產生極其重大的經濟價值。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種誘導蛇足石杉離體葉狀體高產石杉堿甲的方法。
[0006] 本發明所述方法步驟如下： (1) 所用材料:材料為離體培養建立的蛇足石杉葉狀體組織塊，該材料制備方法已申請 專利，（專利號ZL201210005499.6，專利名稱"一種產石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導 和增殖的培養方法"），上述專利的發明人即本專利的發明人； (2) 葉狀體組織塊分割:在無菌條件下，將葉狀體組織塊分成單片葉狀體備用； (3) 誘導葉狀體:將單片葉狀體分別置于3%-6%雙氧水中，浸泡7~15 min，棄雙氧水處 理液，然后用無菌水重復多次洗去雙氧水殘液，將葉狀體接種到繼代培養基上培養； (4) 葉狀體株系恢復生長過程:誘導材料接種在繼代培養基上第三天至第十五天葉狀 體幾乎全變白色，直到20天后，誘導的葉狀體能長出綠色的培養物，以后生長速度加快，50 天左右形成葉狀體組織塊。
[0007] (5)葉狀體株系構建：當代誘導的葉狀體培養50天后，取半致死劑量處理的恢復生 長的培養物建立株系，將每塊葉狀體組織塊分割后建成單個株系，并標記株系代號，以后按 株系繼代擴大培養，每50天為繼代周期，連續培養5代，以高效液相色譜法檢測每個株系的 石杉堿甲含量(ug/g); (6) 重復誘導篩選高產石杉堿甲葉狀體株系:選取石杉堿甲含量較高的葉狀體株系，重 復步驟(2)、（3)，取半致死劑量為3%雙氧水浸泡13~15分鐘脅迫誘導葉狀體，經步驟(4)和 (5)，定向篩選高產石杉堿甲的葉狀體株系； (7) 葉狀體株系分割繼代:分別從每株系取一小部分葉狀體切割成小塊作繼代，接種到 繼代培養基上繼代培養，以后每45~50天轉代一次，分別建成葉狀體無性繁殖株系； (8) 高產石杉堿甲葉狀體株系的建立與鑒定:每株系繼代剩余的另一大部分葉狀體培 養物繼續培養25~35天后收獲，用作提取檢測石杉堿甲含量，連續培養收獲5代，世代間石 杉堿甲含量高且重復一致的株系，鑒定為高產石杉堿甲葉狀體株系。
[0008] 所述繼代培養基按下列成份組成并進行配制： 誘導后葉狀體生長繼代培養基：1/4MS+蔗糖2.5%+瓊脂粉0.6%;培養基的pH值5.8~ 6.0,并在0.1 MPa高溫高壓下滅菌25min后使用。
[0009] 所述培養條件如下： 培養參數:恒溫23±2°C，相對濕度60%~70%，光照強度為1500~18001x，日照時長13~ 15 h/d； 葉狀體誘導半致死劑量為3%雙氧水處理13~15分鐘，篩選獲得高產株系的葉狀體生物 量每代鮮重比接種量增加30~35倍、葉狀體每克干重含石杉堿甲60~88微克。
[0010] 對單片葉狀體誘導試劑為3%-6%雙氧水，浸泡7~15 min，然后用無菌水洗凈殘 液;接種恢復生長，建立株系、繁殖5代，并檢測葉狀體株系的生長量和累積石杉堿甲含量， 選著優良的葉狀體株系繼續重復誘導，定向篩選石杉堿甲高生產率的葉狀體株系。
[0011] 本發明的技術效果是:蛇足石杉離體培養葉狀體再生僅發明人有成功報道和授權 專利（ZL2012100005499.6)。鑒于蛇足石杉離體培養是開發生產原植物源藥用石杉堿甲 (Hup-A)資源的重要技術，本發明又建立了蛇足石杉離體葉狀體每克干重產石杉堿甲60~ 88微克的高產株系，它超過了蛇足石杉母植株每克干重產石杉堿甲58.54微克的含量，突破 了同類研究中的關鍵技術。利用這項技術擴大規模離體培養葉狀體提取生產的藥物石杉堿 甲（Hup-A)將產生極為重大的經濟價值。本發明的誘導方法、培養條件、基質配方為蛇足石 杉離體葉狀體增殖高產株系提供了技術體系。因此，運用本發明的方法進行蛇足石杉離體 培養，可獲得大量高產石杉堿甲的葉狀體藥用植物資源。
【附圖說明】
[0012] 圖1蛇足石杉葉狀體誘導高產株系的培養： 圖IA為雙氧水脅迫誘導后培養10天的生長情況； 圖IB為雙氧水脅迫誘導后培養30天的恢復生長情況； 圖IC為篩選的單株培養系的生長情況； 圖ID為葉狀體來源的野生原植株移植于花缽中供取材的樣本； 圖2高產株葉狀體提取物與原植株提取物、標準品石杉堿甲的高效液相圖譜： 圖2A中箭頭所示標準品石杉堿甲峰； 圖2B中箭頭所示高產株系葉狀體提取物中石杉堿甲峰； 圖2C中箭頭所示野生蛇足石杉原植株枝葉提取物中石杉堿甲峰。
【具體實施方式】
[0013] 以下結合實施例對本發明進行詳細說明。
[0014] 實施例1: 〈一〉取本研究室離體培養建立的蛇足石杉葉狀體組織塊； 〈二〉在無菌條件下，將葉狀體組織塊分成單片葉狀體備用； 〈三〉將單片葉狀體分別置于3%濃度的雙氧水中，浸泡時間7分鐘，棄雙氧水處理液，然 后用無菌水重復多次洗去雙氧水殘液，將葉狀體接種到繼代培養基上培養； 〈四〉誘導處理的葉狀體材料接種在繼代培養基上第三天至第十五天葉狀體幾乎全變 白色，直到20天后，誘導的葉狀體能長出綠色的培養物，以后生長速度加快，50天左右形成 葉狀體組織塊； 〈五〉當代誘導的葉狀體培養50--60d后，取半致死劑量處理的恢復生長培養物建立株 系，將每塊葉狀體組織分割后建成單個株系，并標記株系代號，以后按株系繼代擴大培養， 每50天為繼代周期，連續培養5代，高效液相法檢測每個株系的石杉堿甲含量(ug/g); 〈六〉重復誘導篩選高產石杉堿甲葉狀體株系，選取石杉堿甲含量較高的葉狀體株系， 重復〈二〉、〈三 >取半致死劑量為3%雙氧水浸泡15分鐘誘導葉狀體、重復〈四〉、〈五 > 步驟，