一種通過花藥培養獲得制干辣椒單倍體植株的方法及培養基的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物細胞工程技術領域，具體涉及一種通過花藥培養獲得制干辣椒單倍體植株的方法及培養基。
【背景技術】
[0002]我國是辣椒種植大國，辣椒資源相當豐富，總產量已居世界之首，其中制干辣椒種植面積近600萬畝，年產干辣椒60多萬噸，產值近60億元，已成為農民致富的重要經濟作物之一。新疆具有獨特的種植制干辣椒的氣候條件，是世界適宜種植辣椒的少數地區之一，常年種植面積和產量均占全國的65%以上，加工辣椒產業已成為新疆“紅色產業”的重要組成部分。但適合新疆種植的加工辣椒品種不多，迫切需要通過生物技術手段促進品種選育。
[0003]花藥培養技術是迄今為止創造純合基因型的最有效手段，在育種工作中，利用這項技術除了可以縮短材料的純化時間，對雜交Fl、F2的花藥培養可選擇出特異的性狀外，還可以通過花藥培養方法建立DH群體，直接獲得純化的品系，進而作為育種中間材料或親本育成新品種。
[0004]生物技術和常規育種相結合，已成為當代作物育種的一大特點。應用單倍體培養所得的雙單倍體植株，無論是在作物的育種，還是在遺傳圖譜構建、重要性狀的QTL定位及基因的克隆篩選等分子生物學研究都有著重要的應用價值。目前辣椒花藥培養或小孢子培養仍然存在著基因型限制、培養過程繁瑣、成胚率低、畸形苗率高等需要克服的問題，限制了單倍體育種技術在育種實踐中的應用。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種通過花藥培養獲得制干辣椒單倍體植株的方法及培養基配方。
[0006]本發明的目的可以通過以下實施方案獲得:首先供試辣椒于春季(4月)植于大田中，待現蕾后，選取無病蟲害植株的花蕾。取材時間一般在晴天、無(少)露水時進行，在溫度較低、日照較弱的8:00~10:00進行，選擇花瓣與花萼近等長或根據花藥顏色以1/3為紫色的花蕾，將取好的花蕾立即放于冰盒中，回實驗室后放置4°C冰箱預處理1~7天。
[0007]預處理后的花蕾放在0.1%升汞溶液中表面消毒lOmin，無菌水沖洗3-4次，倒在無菌濾紙上，用兩把尖頭小鑷子一把夾住花蕾底部一把鑷子將花瓣部分拔出，然后將花瓣剝離開取出花藥接種在已滅菌的誘導培養基上，每皿放30個左右的花藥，然后用Paraf i Im 膜封口。
[0008]誘導培養基以改良的MSB培養基為基本培養基，設置兩種激素組合處理(0.1 mg/L 2, 4-D+0.1 mg/L KT和0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L KT)。米用高壓蒸汽滅菌，滅菌時間為15-20 min0
[0009]28 °C恒溫培養箱中，黑暗條件下誘導培養4周后繼代于分化培養基上(生長素減半的誘導培養基)，繼續黑暗培養可見明顯子葉的成熟胚狀體和胚性愈傷組織(圖1-3)。剝離成熟胚狀體，28 °C光照條件(20001UX)下進行生根培養(圖4)，長出發達根系后進行水培煉苗(圖5)，馴化后移栽至營養土和蛭石(3:1)混拌的土缽中(圖6);植株長勢穩健后用脫脂棉蘸取0.25%秋水仙素進行加倍處理48小時(圖7)。
[0010]本發明所提供的進行辣椒花藥培養的基本培養基為改良的MSB培養基，由MS的無機鹽成分和85培養基的有機成分組成，誘導培養基具體組成如下:硝酸鉀1.9 g/L、硫酸銨1.65 g/L、磷酸二氫鉀0.17 g/L、七水硫酸鎂0.37 g/L、二水氯化鈣0.44 g/L、四水硫酸錳22.3 mg/L、硼酸6.2 mg/L、七水硫酸鋅8.6 mg/L、碘化鉀0.83 mg/L、二水鉬酸鈉0.25mg/L、五水硫酸銅0.025 mg/L、六水氯化鈷0.025 mg/L、乙二胺四乙酸鈉37.3 mg/L、七水硫酸亞鐵27.8 mg/L、甘氨酸2mg/L、煙酸I mg/L、鹽酸硫胺素10 mg/L、鹽酸卩比卩多醇I mg/L、肌醇 100 mg/L，鹿糖 30 g/L、瓊脂 9 g/L, pH 為 5.8-6.0。
[0011 ] 所述辣椒為雜交Fl的二倍體辣椒，包括牛角椒、羊角椒、線椒等制干辣椒品種。
[0012]本發明具有以下有益效果:1、從一批來自全國適應新疆種植，生物學形狀優秀的辣椒雜交Fl代或雜交組合進行花藥培養實驗，建立起一套簡便高效的再生體系，達到愈傷組織誘導率達20%以上，出胚率達到5%以上，正常苗率60%以上，10周內獲得完整再生植株。2、本發明的培養方法簡便，僅需要在固體培養基上繼代培養一次后就可以獲得再生植株。3、本發明的培養基是改良的MSB培養基，通過改善了有機物成分促進再生植株根的發育，有利于獲得更多的正常再生植株。
【附圖說明】
[0013]
圖1繼代一次后的胚狀體發生圖2單個花藥分化的成簇胚狀體圖3花藥分化的胚性愈傷組織圖4正常的再生植株圖5水培煉苗圖6再生苗的移栽圖7染色體加倍
【具體實施方式】
[0014]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0015]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0016]無機鹽購自國藥集團化學試劑有限公司和北京化學試劑公司；2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、激動素(KT)和維生素購自SIGMA公司；肌醇購自國藥集團化學試劑有限公司；蔗糖購自北京北化精細化學品有限責任公司，瓊脂粉購自北京振泰科技創新發展中心。
[0017]實驗步驟如下:選擇花瓣與花萼近等長或根據花藥顏色以1/3為紫色的花蕾，放置4°C冰箱預處理I一7天不等。將處理好的材料在超凈工作臺無菌條件下，把花蕾放在
0.1%升汞溶液中表面消毒lOmin，用無菌水沖洗3次。消毒后倒在無菌濾紙上，用兩把尖頭鑷子，一把槍形鑷子夾住花蕾底部一把眼科鑷子將花瓣部分拔出，然后將花瓣剝離開取出花藥接種，每皿放30個左右的花藥，Parafilm膜封口。
[0018]誘導培養基為改良的MSB培養基附加植物激素組成，MSB基本培養基組成為:硝酸鉀1.9 8/1、硫酸銨1.65 g/L、磷酸二氫鉀0.17 g/L、七水硫酸鎂0.37 g/L、二