一種大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUB8及其編碼基因與應用
【技術領域】 本發明涉及植物基因工程領域，具體涉及一種大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUB8及其編 碼基因與應用。
【背景技術】 開花是植物由營養生長向生殖生長轉變的關鍵過程，植物的開花時間直接控制植物營 養生長期和生育期的長短。植物經過長期的演化已經進化出了精確調節開花時間的復雜網 絡，其中，泛素/26S蛋白酶體途徑和類泛素化作為廣泛存在的蛋白質翻譯后修飾形式，在植 物開花時間調控過程中發揮了重要作用。泛素/26S蛋白酶體途徑和類泛素化還可調節蛋白 質功能，參與真核生物體內的細胞周期調控、基因表達調控及生長發育各個過程。 泛素/26S蛋白酶體途徑主要由泛素、泛素激活酶E1、泛素結合酶E2、泛素連接酶E3、去 泛素化酶和26S蛋白酶體組成。目前，PUB類E3泛素連接酶基因先后在擬南芥、水稻等植物中 克隆出來。擬南芥中的PUB類E3泛素連接酶基因在抗高溫、黑暗及干旱脅迫中發揮著重要功 能。
【發明內容】
本發明的目的是提供一種大豆HJB類E3泛素連接酶GmPUB8。 本發明的另一目的是提供該大豆E3泛素連接酶GmPUBS的編碼基因。 本發明的又一目的是提供該大豆E3泛素連接酶的應用。 本發明的目的通過如下技術方案實現： 一種大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUB8，具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。 本發明所述的大豆PUB類E3泛素連接酶的編碼基因 GmPUBS，其最大開放閱讀框序列如 SEQIDN0.1所示，含有1257bp，編碼SEQIDN0.2所示的418個氨基酸殘基。 含有本發明GmPUB8基因 SEQ ID N0.1的表達載體。 所述的表達載體優選將SEQ ID N0.1所示的大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUB8的編碼基 因利用gateway技術插入植物表達載體pMDC83得到的植物過量表達載體pMDC83-GmPUB8。 使用GmPUB8構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動 子。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工， 如加入可在植物中表達的選擇性標記基因(GUS基因、螢光素酶基因等)或抗生素標記物(慶 大霉素標記物、卡那霉素標記物、潮霉素標記物等)的抗性基因。 含有所述大豆HJB類E3泛素連接酶GmPUB8編碼基因的工程菌。 所述的工程菌優選將所述的大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUBS編碼基因轉入根癌農桿菌 EHA105 所得。 擴增所述大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUB8編碼基因的引物，正向引物序列為SEQ ID NO.3,反向引物序列為SEQ ID NO.4。 擴增所述大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUB8編碼基因的實時熒光定量RT-PCR引物，正向 引物序列為SEQ ID NO.5,反向引物序列為SEQ ID NO.6。 所述的大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUBS在不同光周期下調控開花時間方面的應用。所 述的大豆PUB類E3泛素連接酶GmHJBS的編碼基因在不同光周期下調控開花時間方面的應 用。 有益效果： 本發明在大豆基因組中克隆得到一種大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUBS的編碼基因 GmPUB8，GmPUB8基因在大豆組織器官中特異性表達。轉基因擬南芥中過量表達GmPUB8基因， 與對照組相比，在長日照下開花比野生型植株晚，開花時間推遲5天以上，開花時蓮座葉片 數較對照增加11片以上；在中日照和短日照下培養，過表達GmPUBS擬南芥植株與對照組相 比，開花比野生型植株早，開花時間分別提前9天和13天以上，開花時蓮座葉片數較對照分 別減少11片和13片以上。上述結果說明GmPUBS可以在不同光周期下調控植物的開花時間。 本發明的GmPUBS為在不同光周期下調控大豆的開花時間提供基因材料與理論基礎。
【附圖說明】 圖1 GmPUB8蛋白系統進化樹 圖2 GmPUB8基因在大豆中的表達特性。 其中：1，根;2,莖;3,葉片;4,花;5,開花后5天幼莢;6,開花后10天幼莢；7,開花后15天 幼莢；8,開花后20天幼莢；9,開花后25天幼莢；10,開花后30天幼莢；11，開花后35天幼莢； 12,開花后40天幼莢；13,開花后45天幼莢；14,開花后50天幼莢。 圖3含有重組表達載體pET24b-GmPUB8的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS菌液PCR產物電泳圖 譜。 其中：1，DNA marker;2，含有重組表達載體pET24b-GmPUB8的大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS 菌液PCR產物。 圖4 GmPUB8重組蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖。 其中：1，蛋白marker; 2，含有空載體pET24b的大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS誘導12h; 3，含 有重組表達載體pET24b-GmPUB8的大腸桿菌BL21 (DE3) pLy s S誘導12h。 圖5 GmPUBS的體外泛素化活性檢測。 利用原核細胞體外重組表達并純化的GmPUB8-6X組氨酸(His)融合蛋白與兔子泛素激 活酶E1、人泛素結合酶E2及泛素(Ub)混合后，30°C孵育1.5小時。樣品經過聚丙烯酰胺凝膠 電泳(SDS-PAGE)分離，分別采用ant i-Hi s和ant i-Ub的抗體進行蛋白雜交檢測。 圖6 GmPUB8過量表達植物表達載體的構建。 圖7轉GmPUB8基因擬南芥和對照組RT-PCR檢測。 WT:野生型;#1-9:轉基因型。 圖8轉GmPUB8基因擬南芥和對照在不同光周期條件下的表型觀察。 WT:野生型;#9:轉基因株系。 圖9轉GmPUB8基因擬南芥和對照植株在不同光周期條件下的蓮座葉片數和開花時間比 較。**表示野生型WT與轉基因株系在0.01水平差異顯著。
【具體實施方式】 在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解 的含義。 下面結合具體的制備實施例和應用實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發明。應 理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。 在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所用 到的引物，均在首次出現時標明，其后所用相同引物，均以首次標明的內容相同。 下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規方法。 實施例1 GmPUB8基因的克隆與鑒定 實驗材料為大豆(Glycine max(L. )Merr.) '科豐1號'，由南京農業大學國家大豆改良 中心種質庫提供，材料種植于溫室，常規田間管理。 根據擬南芥中已克隆的PUB類E3泛素連接酶AtPUB23 (At2g35930)序列，在Phy tozome中 的大豆基因組數據庫中進行BLASTP搜索，利用生物信息學的方法進行分析，設計GmPUBS基 因開放閱讀框(0RF)正向引物GmPUB8-0RF-F: 5 '-ATGGACGAGATCGACGTGCC-3 '（ SEQ ID NO · 3) 和反向引物GmPUB8-0RF-R:5'-TCACGAACTCATTGGAAACGAAG-3'（SEQIDN0·4)，以大豆嫩葉 的cDNA為模板進行PCR擴增GmPUB8的0RF，具體方法如下：取大豆'科豐1號'嫩葉片，置于液 氮中研碎，RNA提取依據TIANGEN總RNA提取試劑盒RNA Plant Extraction Kit DP417進行。 cDNA第一鏈合成依據TaKaRa試劑公司cDNA第一鏈合成試劑盒TaKaRa PrimeScript? 1st strand cDNA Synthesis Kit D6110A，具體詳見操作說明。以得到的cDNA片段為模板，用上 述引物對進行PCR反應擴增。50μ1 PCR反應體系為：2μ1 cDNA第一鏈(0.05yg)、1.6μ1引物 (SEQ ID Ν0.3和SEQ ID Ν0·4,5μΜ)、5μ1 10XPCR緩沖液、4μ1 Mg 2+、4μ1 dNTP和 1.25U Ex Taq DNA聚合酶，用超純水補足50μ1。反應在BIO-RAD PTC-200型PCR儀上進行，其程序為95 。(:變性 5111丨11;941€3〇86(3,581€3〇86(3,72 1€21^11，共35個循環；然后72°(：延伸1〇1^11;4°(：保存。 PCR產物用膠回收試劑盒(天根）回收后連接PMD19-T載體(TaKaRa)、轉化大腸桿菌DH5a感受 態細胞、藍白斑篩選、搖菌、測序。序列分析結果表明PCR產物具有序列表中SEQID NO. 1的核 苷酸序列，命名為GmPUB8。從NCBI中收集多個物種的PUB類E3泛素連接酶PUB蛋白序列， ClustalX進行蛋白序列比對分析，發現GmPUB8與其他物種中的同類蛋白序列同源度較低， 與擬南芥中的AtPUB22和AtPUB23的同源性分別達到69.91 %和53.83%。然后構建了大豆 GmPUB8基因與其他物種PUB基因的系統化樹(圖1)。 實施例2大豆GmPUB8基因在不同器官中的表達特征 以大豆品種'科豐1號'為材料，利用實時熒光定量RT-PCR技術對大豆不同組織根、莖、 葉片、花及開花后不同時間茄果中的表達情況進行了研究。各組織總RNA的提取及cDNA第一 鏈合成同實施例1，具體步驟參照試劑盒說明書進行。根據GmPUBS基因序列設計實時熒光定 量PCR檢測引物GmPUB8-qPCR-F: 5 ' -TCGTGTGCCCTATTTCATTAGAGC-3 '（ SEQ ID NO · 5)， GmPUB8-qPCR-R:5 '-TGCGGAGCGTGTGGTTCG-3 '（SEQ ID NO·6);內參基因采用大豆Actinl 1基 因 （Hu et al，2009，BMC Molecular Biology，10:93)，引物序列為八。衍111卜卩：5'-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3 '（SEQ ID NO.7)，Actin11-R:5 '-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3 ' (SEQ ID NO.8)。以來自不同組織的cDNA為模板進行實時熒光定量RT-PCR分析。 結果分析表明（圖2)，GmPUB8雖然在不同組織中均有表達，但在根中的表達量最高，在 開花后5d幼莢中的表達量最低。 實施例3 GmPUB8基因的異源表達及泛素連接酶活性測定 一、 攜帶GmPUB8基因重組表達載體的構建 以大豆cDNA為模板，根據序列SEQ ID No.l設計引物，PCR擴增大豆PUB類E3泛素連接酶 GmHJB8基因編碼區的DNA序列。引物兩端分別引入Nhe I和Xho I酶切位點，引物序列為 GmPUB8-pET24b