Cd133質粒的新用圖
【技術領域】
[00011本發明涉及⑶133質粒的新用途。
【背景技術】
[0002] 乳腺癌是世界范圍內女性最常見的惡性腫瘤。大量證據表明正是由于乳腺癌干細 胞(Breast Cancer Stem Cell,BCSC)的存在導致其容易轉移，復發且對放化療抵抗。而近 年來興起的過繼細胞免疫療法(adoptive cell immunotherapy，ACI)是一種針對放化療不 敏感腫瘤的新療法，臨床前景廣闊，獲得越來越多的重視。
[0003] CSC的存在是影響乳腺癌治療效果和預后最重要的因素之一，目前臨床上應用的 放化療通常只能消除普通乳腺癌細胞，而對放化療抵抗的殘存BCSC仍能不斷增殖，導致乳 腺癌復發轉移，所以尋找一種行之有效的殺滅CSC的方法成為乳腺癌治療的新方向。ACI是 一種依賴自體效應性免疫細胞的體外擴增進行腫瘤細胞有效殺滅的新型療法，其首先應用 于惡性白血病的治療，后逐步推廣至包括乳腺癌、乳腺癌、肺癌等在內的實體腫瘤。ACI的效 應細胞主要包括細胞因子誘導的殺傷細胞(CIKs)，淋巴因子激活的殺傷細胞(1711^11〇1^116-activated killer cells，LAKs)，腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes, TILs)、細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte cells,CTLs)及新近提出的嵌合抗 原受體的T細胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)等。而作為體內功能最強大 的專職抗原提呈的DC也是ACI重要的組成部分。
[0004] CIK細胞具有增殖快速、殺瘤力強、殺瘤譜廣、對正常細胞無殺傷作用、對耐藥腫瘤 敏感等優點，是目前已知的活性最高的非特異性殺傷免疫效應細胞。DC能夠將腫瘤抗原提 呈給免疫活性細胞，促進其增殖活化，增強對腫瘤細胞的殺傷活性。有研究表明，負載腫瘤 干細胞抗原的DC免疫表型較前成熟，而將其與CIK細胞共同培養后，DC-CIK免疫表型進一步 成熟且分泌細胞因子水平相應提高。
[0005] ⑶133是乳腺癌干細胞最重要的分子標記，它是一種單跨膜糖蛋白，通過與多種配 體的結合在細胞粘附和迀移等行為中發揮關鍵作用。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題在于提供⑶133質粒的新用途。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：
[0008] ⑶133質粒在增強DC-CIK對乳腺癌干細胞的體外殺傷作用方面的應用。
[0009] 優選的，上述CD133質粒的應用，以CD133質粒沖擊DC(dendritic cell)后與CIK (cytokine-induced killer)細胞聯合培養使DC-CIK對乳腺癌干細胞的體外殺傷效果增 強。
[0010] 優選的，上述⑶133質粒的應用，所述⑶133質粒的序列為序列表〈400>1所示序列。
[0011] 本發明的有益效果是：
[0012] CD133質粒在增強DC-CIK對乳腺癌干細胞的體外殺傷作用方面具有重要應用價 值。
【附圖說明】
[0013] 圖1 CSC-RNA誘導的樹突狀細胞；
[0014]圖2 CSC-裂解物抗原誘導的樹突狀細胞；
[0015]圖3輔助質粒和目的質粒共轉染293T 24h和48h的綠色熒光強度；
[0016]圖4用濃縮的慢病毒去侵染293T細胞，12h換液，48后的熒光強度。
【具體實施方式】
[0017] 為了使本領域的技術人員更好的理解本發明的技術方案，下面結合【具體實施方式】 對本發明所述技術方案作進一步的詳細說明。
[0018] 實施例1
[0019] -、乳腺癌MCF-7細胞干細胞全細胞裂解物的制備
[0020] 收集乳腺癌MCF-7細胞及其干細胞細胞、分別調整細胞濃度至1 X 10T(MCF-7細胞 及其干細胞細胞:DC細胞=10:1 )，轉至凍存管中，將凍存管放入液氮15min，取出后立即放 入37 °C水浴鍋中15min，反復4次，裂解后，4 °C離心，10000g離心1 Omin，收集上清，0.22um濾 膜過濾除菌，存于-80°C備用。用BCA法測定上述裂物蛋白濃度的，按BCA試劑盒說明書進行 蛋白濃度測定。
[0021 ] 乳腺癌MCF-7細胞干細胞總RNA的提取
[0022] 按照Qiagen Rneasy mini kit試劑盒說明書操作。收集對數期生長的MCF-7細胞 及磁珠分選的MCF-7干細胞，計數不少于1 X 107個，移至無 RNase的1.5ml EP管中，加入600μ 1 Buffer RLT，用lml無菌注射器反復吹打5-8次至細胞完全裂解，然后，加入600μ1 70 %乙 醇混勾，8000g離心15s，棄流穿液，加入700μ1 RW1 Buffer至收集柱中，8000g離心15s洗滌 收集柱，再加入含有1〇μ1 DNase的Buffer RDD 80μ1于收集柱中20-30°C孵育15min徹底消 化基因組DNA。加入350μ1 RW1 Buffer至收集柱中，8000g離心15s洗滌收集柱，然后加入500 μL RPE Buffer至收集柱中，8000g離心2min徹底洗滌收集柱，棄流穿液。將收集柱置于新的 1.5ml EP管中，加入30-50μ1無 RNase的去離子水，離心8000g離心lmin，收集洗脫下來的 RNAAanodrop 2000分光光度計檢測提取的RNA濃度。
[0023]⑶133慢病毒表達體系的構建
[0024] 1.1.1.1引物設計
[0025] 以 pCDNA3.1+CD133(sl6-s24)為模板
[0026] 引物:CDUSFW -CGGAATTCATGGGTGCAAATGTGGA-3'(序列表〈400>2所示序列）
[0027] CD133R: 5' -ATAAGAATGCGGCCGCTCACAAGGGGTCGATAATGTAGC-3'(序列表〈400>3所示 序列）
[0028] 1.1.1.2 PCR擴增
[0029] 反應體系：按順序加入以下7種成分，混勻： 母液濃度 50.μ1體系加入量:￡μ1> Buffer 1 () X 5 dNTP 2.5 ηιΜ 4 引物 F 10uΜ： .2
[0030] 引物 R 10 ιιΜ 2 聚合酶 5?7μ1 0.25 c!dH20 - 35.75 模板 （適當稀釋） 1
[0031] 反應程序： PCR反座程序:95°C 2min 95 JC 30s
[0032] 58 C 30s 72 °G 1 mi n 3Q*Gye I e 72〇C 7m in
[0033] PCR產物膠回收，用EcoRI和Notl雙酶切后與我們提供的過表達對照載體相連接。
[0034] 1.1.1.3酶切 [0035]片段酶切： 上游內切酶 1.5 μL 下游內防酶 1,5 μL
[0036] 共用 buffer (l〇x) 5 μL PCR回收產物 30 μL ddH20 補 ?5()μ1.
[0037] 37 °C消化2_3h。電泳切膠回收(酶切回收試劑盒，TaRaKa)
[0038] 載體酶切： 上游內切酶 1.5 μ1 下游內切酶 1.5 .μL
[0039] 共用 buffer (1〇χ) 5: μ1 載體 20 μL del Η 20 補至 50 μL
[0040] 37 °C消化2-3h。電泳切膠回收(瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，ΒΡΙ)
[0041 ] 1.1.1.4連接、轉化
[0042] (1)連接：1μ1 載體，3μ1 酶切回收產物，ΙμL連接酶(ΒΡΙ)，5μ1 2XRapid Buffer，混 勻，室溫反應30min。
[0043] (2)轉化:取出一 80 °C保存的100μΙ感受態細胞(BL21)，放在冰上緩慢解凍。將感受 態細胞加入連接產物中混勻，冰上放置3〇11^11。42°(：熱激90s。冰浴2min后，加入800μ1無抗性 的LB培養基。37 °C培養45min。5000rpm離心3min，棄大部分上清，留約100-150μ1，重懸菌體， 選擇有相應抗性的LB平板，涂板。晾干，于37°C培養箱中倒置培養過夜。篩選陽性克隆，質粒 提取，并測序。
[0044] 1 · 1 · 1 · 5質粒提取(去內毒素）
[0045] 將帶有質粒的E.coli接種于200ml LB/抗生素培養液中，37°C搖床培養12h;取 200ml的菌液，室溫下5000g離心10min收集細菌。倒棄培養基。加入10ml Solution 1/ RNaseA混和液，漩禍振蕩使細胞完全懸浮。往重懸混和液中加入10ml Solution II，輕輕顛 倒混勻7-10次后可將混合液室溫放置2min以提高產量。避免劇烈混和裂解液且裂解反應不 要超過5min。加入5ml冰浴Buffer N3,并溫和顛倒離心管10次至形成白色絮狀沉淀。準備好 過濾器。把HiBind中量柱套在收集管中，加入3ml Buffer GPS至柱子中，靜置3-5min。室溫 5000g離心5min。去濾液，把柱子重新放回收集管中。加入10ml無菌水，5000g離心5min。將裂 解液倒進預先準備好的針筒過濾器中（針筒開口朝上，下面出口處接收集管），靜置2min。插 入并輕推活塞使裂解液流進下面的收集管中。在過濾澄清的裂解液中加入1/10體積的ETR， 顛倒7-10次后溶液變得渾濁，冰浴2〇11^11。42°(：水浴5min后，25°C，5000g離心5min，ETR溶液 將在管底形成藍色分層。離心后，如果溶液中有大量的液滴懸浮，靜置lOmin讓液滴自然沉 降。轉移上清液移至離心管中，加入0.5倍體積無水乙醇（室溫），混勻后室溫靜置2min。將 HiBind大量柱裝在50ml收集管中。轉移20ml混合液至柱子內，室溫下5000g離心5min，倒去 濾液。重復該步驟，把剩余的過濾液轉移至柱子，直至所有的溶液都從柱子濾出。把柱子重 新裝回收集管，加入l〇ml HB Buffer，按上述條件離心，棄濾液。把柱子重新裝回收集管，加 入15ml DNA Wash Buffer，按上述條件離心，棄濾液，重復一次。把柱子重新裝回收集管，最 大速度(<6000g)離心15min以甩干柱子基質。把柱子裝在干凈的50ml離心管上，加入70°C預 熱3ml Endotoxin free Elution Buffer到柱子基質上（所加的量取決于預期終產物濃 度），室溫下靜置5min后4000g速度離心5min以洗脫DNA。取10μ1用微量核酸定量儀定量。 [0046] 1.1.1.6慢病毒包裝
[0047]用明膠(0.2% )包被10cm dish在4°C下孵育過夜。胰酶消化前期培養的293Τ細胞， 均勻鋪板待細胞融合度達到70%_90%方可進行包裝。小心吸取細胞培養基上清液，加入 6mL無血清無雙抗DMEM，放入培養箱待用。制備轉染試劑與DNA復合物，取無菌無酶EP管2只， 其中1只分別加入1號輔助質粒6.5yg，2號輔助質粒2.5yg，3號輔助質粒3.5yg，目的質粒15μ g(若包裝對照慢病毒將目的質粒更換為對照質粒即可）另一只ΕΡ管加入55μ1轉染試劑 (lmg/ml)。使用無菌過濾roS或DMED分別將兩只ΕΡ稀釋至500μ1，吸取轉染試劑500μ1加入4 質粒中輕柔吹打混勻(注:切記不可渦旋，不可將加入順序顛倒）。靜止放置20min，快速逐滴 加入待用的培養皿中，8字混勻培養皿后放入培養箱。6h后換新鮮完全培養基12mL。換液后 48h收集上清，1000g lOmin離心或0.45μηι無菌濾器過濾。
[0048] 1 · 1 · 1 · 7慢病毒濃縮 PEG-8000:
[0049] 5倍濃度PEG8000，121°C30min濕熱滅絕30min;保存在4°C ;使用0.45μπι濾頭過濾慢 病毒上清液；每301111過濾后的病毒初始液，加入5倍濃度1^6-8000加他(：1母液7.51111;每 30min混合一次，共進行3-5次;4°C放置過夜；4°C，4000g，離心20min;吸棄上清，靜置管子 2min，吸走殘余液體;加入適量的（10ml對應100μ1)慢病毒溶解液(PBS)溶解慢病毒沉淀;濃 縮后的病毒懸液分裝成50yl每份，保存在成品管中，用碎干冰速凍后儲存在_80°C。
[0050] 1.1.1.8病毒低度檢測:利用GFP熒光細胞數進行病毒滴度測定
[0051] 滴度單位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數。"TU"為 "