一種野生蟬花液體菌種人工培養的優化方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物菌劑領域，尤其涉及一種野生蟬花液體菌種人工培養的優化方 法。
【背景技術】
[0002] 蟬花又名金蟬花、蟬茸、蟬蛹草、蟲花等，為麥角菌科真菌大蟬草寄生在蟬科昆蟲 若蟲上的子座及若蟲尸體的復合體。蟬花的主要成分有蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、氨基酸、 多種維生素、麥角留醇、蛋白質以及超氧化物歧化酶等，蟬花與冬蟲夏草的無性型同屬，它 的所含成分和藥用價值能夠與冬蟲夏草媲美。具有鎮痛、鎮靜催眠、抗高血壓、雙向免疫調 節、抗腫瘤生成及抗炎、改善腎功能等作用。
[0003] 自然界中的蟬花資源非常稀少，又由于大量的采挖造成其生長環境的嚴重破壞， 使得野生蟬花成為稀世良藥，市場上供應蟬花主要是蟬擬青霉，蟬花是綠色健康食品具有 廣闊的市場，目前中國在蛹蟲草規模化生產的菌株品種較少，生產成本大，品質不高、生長 緩慢、退化嚴重、抗逆性差，遠遠不能滿足規模化生產的需要。
[0004] 目前人工栽培方式主要有三種，一種是從野生蟬花分離，純化菌種后接種在含蟬 蛹粉的固體培養上，以大米代料培養為主，二是將蟬花菌種接種在柞蠶，家蠶幼蟲或活蛹等 體內后按第一種的方法條件培養，三是以玉米，蔗糖為培養基采用液體發酵培養蟬花。但不 管采取哪一種栽培方式均需要獲得大量優質的液體菌種，現有的培養基配方以及培養方式 并沒有使得在野生蟬花液體培養過程中野生蟬花菌絲得到最優的生長，對菌液的質量和產 量都產生了一定的影響。
[0005] 目前尚無一套系統有效的對野生蟬花液體菌種生產中最優碳源、氮源及微量營養 素的篩選的優化培養方式，從而為野生蟬花的規模化栽培提供優良菌種技術指導。
【發明內容】
[0006] 發明目的：為了克服現有技術中存在的野生蟬花液體菌種培養過程中存在的問 題，本發明提出了一種系統有效的對野生蟬花液體菌種生產中最優碳源、氮源及微量營養 素的篩選的優化培養方式，為野生蟬花的規模化栽培提供優良菌種技術指導的一種野生蟬 花液體菌種人工培養的優化方法。
[0007] 技術方案:為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案為:一種野生蟬花液 體菌種人工培養的優化方法，包括如下步驟：
[0008] (1)優化液體培養基的配方：可溶性淀粉20g，奶粉10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂 lg，維生素 B12 10片，水 1000mL，pH 5.0-6.0;
[0009] (2)優化液體培養基的配制：按照步驟（1)中的配方準確稱量各藥品，以配制 1000mL培養基為例，量取1000mL的水用電磁爐燒開，然后按照易溶到不易溶的順序依次將 藥品加入水中，用玻璃棒攪拌直至溶解;將配制好的培養基分裝到500ml的三角瓶中，每個 三角瓶裝150ml，分裝時避免培養基粘在三角瓶口壁上，如粘上則用紗布擦干凈否則易滋生 雜菌；用封口膜封口，并貼上標簽;放在高壓滅菌鍋內滅菌，在壓力為o.l-o. 2MPa，溫度為 121°C下，滅菌40min，待其壓力降至零時，打開壓力鍋蓋取出三角瓶放置冷卻備用；
[0010] (3)接種:將已滅過菌的三角瓶、接種工具、酒精棉球、酒精燈、接種環等放入超凈 工作臺中，開啟紫外線燈照射30min，用70%的酒精對菌種培養皿進行消毒，操作人員的手 帶無粉乳膠手套并用70%酒精消毒；點燃酒精燈，在酒精燈火焰無菌區范圍內，將接種針和 打孔器在酒精燈火焰上灼燒消毒，用打孔器在蟬花平板菌種表面進行打孔，打孔時沿菌落 最外緣向中間逐次打，邊緣的菌絲生長能力比較旺盛；用消毒過的接種針挑1個菌餅塊，沿 著三角瓶封口薄膜一側揭開一條縫，通過酒精燈火焰的無菌區，將菌餅塊掉入三角瓶內，每 個三角瓶內接2塊的菌餅塊;放菌餅塊的時候不要接觸到瓶壁，避免污染；
[0011] (4)培養:接種后將三角瓶移至19°C的恒溫振蕩搖床中靜止培養24h，后在恒溫19 °C，轉速為120r/min的恒溫振蕩搖床繼續培養6-7天。
[0012] 更為優選的，所述步驟(2)中的分裝采用漏斗進行分裝，以避免培養基粘在三角瓶 口壁上易滋生雜菌。
[0013]有益效果:本發明提供的一種野生蟬花液體菌種人工培養的優化方法，采用優化 的液體培養基配方:可溶性淀粉20g，奶粉10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂lg，維生素 B12 10 片，水1000mL，pH 5.0-6.0;對野生蟬花菌種進行人工培養，在傳統基礎培養基的基礎上，提 出了一種系統有效的對野生蟬花液體菌種生產中最優碳源、氮源及微量營養素的篩選的優 化培養方式，為野生蟬花的規模化栽培提供優良菌種技術指導。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明：
[0015] 實施例1:
[0016] -種野生蟬花液體菌種人工培養的優化方法，包括如下步驟：
[0017] (1)優化液體培養基的配方：可溶性淀粉20g，奶粉10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂 lg，維生素 B12 10片，水 1000mL，pH 5.0-6.0;
[0018] (2)優化液體培養基的配制：按照步驟（1)中的配方準確稱量各藥品，以配制 1000mL培養基為例，量取1000mL的水用電磁爐燒開，然后按照易溶到不易溶的順序依次將 藥品加入水中，用玻璃棒攪拌直至溶解;將配制好的培養基分裝到500ml的三角瓶中，每個 三角瓶裝150ml，分裝時采用漏斗進行分裝，以避免培養基粘在三角瓶口壁上易滋生雜菌， 如粘上則用紗布擦干凈否則易滋生雜菌;用封口膜封口，并貼上標簽;放在高壓滅菌鍋內滅 菌，在壓力為〇.1-〇.210^，溫度為121°(：下，滅菌4〇 1^11，待其壓力降至零時，打開壓力鍋蓋取 出三角瓶放置冷卻備用；
[0019] (3)接種:將已滅過菌的三角瓶、接種工具、酒精棉球、酒精燈、接種環等放人超凈 工作臺中，開啟紫外線燈照射30min，用70%的酒精對菌種培養皿進行消毒，操作人員的手 帶無粉乳膠手套并用70%酒精消毒；點燃酒精燈，在酒精燈火焰無菌區范圍內，將接種針和 打孔器在酒精燈火焰上灼燒消毒，用打孔器在蟬花平板菌種表面進行打孔，打孔時沿菌落 最外緣向中間逐次打，邊緣的菌絲生長能力比較旺盛；用消毒過的接種針挑1個菌餅塊，沿 著三角瓶封口薄膜一側揭開一條縫，通過酒精燈火焰的無菌區，將菌餅塊掉入三角瓶內，每 個三角瓶內接2塊的菌餅塊;放菌餅塊的時候不要接觸到瓶壁，避免污染；
[0020] (4)培養:接種后將三角瓶移至19°C的恒溫振蕩搖床中靜止培養24h，后在恒溫19 °C，轉速為120r/min的恒溫振蕩搖床繼續培養6-7天。
[0021] 培養菌種質量對比試驗：
[0022] 1)對比試驗1:
[0023] 碳元素是真菌最重要的營養，它不僅是碳水化合物還是蛋白質的基本組成元素， 同時又是重要的能源來源。本發明優化培養基配方中碳元素的供給選擇都是可溶性淀粉， 將實施例1中培養基配方中的可溶性淀粉分別等量替換成傳統培養方法中的葡萄糖、麥芽 糖、蔗糖、乳糖，其余成分不變和培養方法不變，用以下測定方法對培養基的pH值以及培養 第三天的菌絲球直徑、密度和重量分別進行測定：
[0024] a)菌絲球直徑的測定
[0025]接種后48h開始測定，以后每隔24h測定一次。每次測量取液均需要在超凈工作臺 內進行，取液時先用lmL移液槍槍頭移取3次，共取出3mL培養液放入墊有吸水紙的培養皿 中，按lmL培養液含菌球大小的數量比隨機取十個菌絲球排成一行用游標卡尺測總長度，并 計算出平均每個菌絲球的直徑。
[0026] b)菌絲