一種制備高純度沒食子兒茶素沒食子酸酯gcg的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種制備高純度沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG的方法，尤其涉及表型兒茶素異構體化合物的高溫轉化及其單體化合物的制備、分離和純化的方法。
【背景技術】
[0002]茶葉中的兒茶素主要為表型兒茶素，即表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG、表沒食子兒茶素EGC、表兒茶素沒食子酸酯ECG、表兒茶素EC，它們約占兒茶素總量的60?80%。其中EGCG是綠茶茶多酚中含量最高的物質，也是目前公認的茶葉中最主要的抗氧化成分。然而現有研究已經證實，表型兒茶素的異構體如沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG等(其化學結構如附圖1所示)在某些方面表現出較強的生理活性，如抗氧化和清除自由基活性等。
[0003]兒茶素單體化合物主要是從茶葉或茶葉提取物中進行提取，常用的分離純化方法有液液萃取、柱層析、中低壓柱色譜、高壓制備液相色譜和高速逆流色譜分離等。兒茶素的分離純化不乏其他方法，也常常采用兩種或多種方法聯合使用。文獻及專利中常見表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG、表兒茶素沒食子酸酯ECG等的分離純化報道，但制備沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG單體化合物的方法較少。公開專利CN 1562995A《高純度茶多酚和單體兒茶素的制備工藝及其裝置》，采用柱層析的方法純化制備單體兒茶素，如沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG，但茶葉中沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG含量較低，該方法提取效率不高。公開專利CN 102120738 A《一種非表型兒茶素單體的制備方法》，以兒茶素單體化合物為原料，經高溫加壓熱轉化和凝膠介質分離等過程制備非表型兒茶素。如以表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG為原料，得到純度99.1%的沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG單體化合物，但該方法所用原料成本高；同時，在轉化過程中加入鈉鹽或鉀鹽的堿金屬，引入了無機鹽等雜質，且采用凝膠分離純化的方法，所制備的單體化合物純度較低。
[0004]鑒于沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG良好的營養保健和生理藥理作用，在茶葉及茶葉相關制品的質量控制、生產工藝的優化及其基礎功效學的研究過程中，需要高純度的沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG單體化合物。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是制備沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG純度大于99%的高純單體化合物。本發明研制的高純度沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG單體化合物，可用于茶葉及其制品中相關物質含量監測的質量控制，相關物質基礎營養、保健、生理、藥理學功效的研究，以及相關物質對照品和標準物質的研制等領域。
[0006]本發明是通過如下技術方案實現的，其制備流程如附圖2所示。
[0007]步驟1.茶多酚溶液的配制步驟1-1.茶多酚樣品的篩查綠茶茶多酚中兒茶素的含量較高，優選綠茶茶多酚。市售綠茶茶多酚中兒茶素(總量)的含量有20%、40%、60%、80%、90%、95%、98%等諸多品種，優選兒茶素(總量)含量較高的品種。市售綠茶茶多酚中咖啡因的含量為0%?50%不等，優選咖啡因含量較低的品種。
[0008]步驟1-2.料液的配制
稱取步驟1-1優選的一定量的綠茶茶多酚樣品，加適量溶劑，攪拌超聲溶解，配制一定濃度的料液。溶劑可選擇超純水、甲醇、乙腈、乙醇等或其混合溶液，優選超純水作為溶劑；料液濃度可以配制100?1000 mg/mL，優選300 mg/mL。
[0009 ]步驟2.料液的高溫轉化
取適量配制的料液，于適當溫度轉化一定時間。轉化溫度可選100?150° C，優選130° C。轉化時間可選10~300 min，優選120 min。
[0010]步驟3.轉化液的快速制備液相色譜分離步驟3-1.快速制備液相色譜分離
快速制備液相色譜可以選擇多種類型的色譜填料，如Cl 8、C8、C4等，優選Cl 8填料。填料粒徑可以選擇5?100 μπι，優選20?40 μπι的填料。快速色譜柱的尺寸規格以及填料裝填質量可以選擇多種，本發明使用裝填質量為120 g的填料。
[0011]快速制備液相色譜分離中，可以選擇多種流動相體系，如水、甲醇、乙腈、乙醇等，或其適當比例的混合液，本發明中采用甲醇-水體系。流動相中可以添加不同種類及不同含量的調節劑，如甲酸、乙酸、磷酸等，或其相應的緩沖鹽體系，本發明采用水相中添加0.1%(體積比)的乙酸。
[0012]快速制備液相色譜分離中，可以優化多種分離條件，如上樣量、流速、等度或梯度洗脫方式等。本發明采用粒徑為20?40 μπι，填料質量120 g的快速制備液相色譜柱，優化的快速制備液相色譜分離條件如下:流動相A:甲醇，流動相B:含0.1%(體積比)乙酸的水溶液；流速:50 mL/min;梯度洗脫:15%A (O min) - 20%A (5 min) - 25%A (10 min) - 30%A(25 min) - 35%A (30 min) - 50%A (40 min);上樣量:3 mL;檢測波長:278 nm。
[0013]取適量步驟2制備的轉化液，用0.22Mi微孔濾膜過濾，在步驟3-1優選的快速制備液相色譜分離條件下，收集23.5-25.8 min的沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG餾分。多次進樣，收集合并沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG餾分。
[0014]步驟3-2.快速制備液相色譜收集沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG餾分純度的檢測采用高效液相色譜法檢測快速制備液相色譜收集沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG餾分的純度，結果顯示純度大于90%。
[0015]所使用的高效液相色譜分析方法如下:色譜柱:C18，5μπι, 4.6*250mm;色譜柱溫度:35 ° C;流動相A:甲醇;流動相B:含0.1%(體積比)乙酸的水溶液;等度洗脫:25%A;流速:ImL/min;檢測波長:278 nm;進樣量:10 yLo
[0016]步驟3-3.對步驟3-1快速制備液相色譜收集的沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG餾分，采用旋轉蒸發的方法去除甲醇，濃縮液再經過冷凍干燥，制得沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG單體化合物粗品。
[0017]步驟4.沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG單體化合物粗品的高壓制備液相色譜分離步驟4-1.高壓制備液相色譜上樣液的配制
稱取一定量步驟3-3制備的沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG單體化合物粗品，加適量溶劑溶解，配制一定濃度的溶液。本發明中，濃度為40 mg/mL，溶劑為25%(體積比)甲醇水溶液。
[0018]步驟4-2.高壓制備液相色譜分離高壓制備液相色譜分離中，可選擇不同種類和不同粒徑的色譜填料，以及不同尺寸規格和填料質量的色譜柱。本發明中，在優選條件下，采用C18填料，填料粒徑為10 μπι，色譜柱尺寸為21.5*250 mm。
[0019]對優選的高壓制備液相色譜柱，可以優化多種分離條件，如上樣量、流速、等度或梯度洗脫方式等。本發明中優化的高壓制備液相色譜分離條件如下:流動相A:甲醇;流動相B:含0.1%(體積比)乙酸的水溶液;等度洗脫:25%A;流速:25 mL/min;上樣量:2 mL;檢測波長:278 nm。
[0020]在優化的高壓制備液相色譜分離條件下，收集沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG餾分。多次進樣，收集并合并沒食子j L茶素沒食子酸酯GCG餾分。
[0021]步驟4-3.高壓制備液相色譜收集沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG餾分純度的檢測對高壓制備液相色譜收集的沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG餾分，進行高效液相色譜分析，分析方法如步驟3-2，結果顯示沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG的含量大于99%。
[0022]步驟4-4.高壓制備液相色譜收集沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG餾分的濃縮干燥對步驟4-2高壓制備液相色譜收集的沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG餾分，通過旋轉蒸發、冷凍干燥和真空干燥，制得沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG高純單體化合物。
[0023]步驟4-5.沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG高純單體化合物純度的檢驗
分別稱取一定量步驟4-4制備的沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG高純單體化合物，加適量50%(體積比)甲醇溶液溶解，配制濃度為0.5 mg/mL的溶液，進行高效液相色譜分析檢測，分析方法如步驟3-2所示。采用面積歸一化法計算相應主成分的含量，結果顯示沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG的HPLC純度大于99%。
[0024]本發明以綠茶茶多酚為原料，經過高溫轉化、快速制備液相色譜和高壓制備液相色譜分離純化，制備了高純度沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG單體化合物，本發明具有如下有益效果:
本發明所用原料市場供應充足，綠茶茶多酚中兒茶素含量較高，適于作為原料制備本發明所述的沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG高純單體化合物。
[0025]本發明采用高溫轉化的方法，提高了綠茶茶多酚溶液中沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG的含量。
[0026]本發明采用快速制備液相色譜的方法進行料液的初步分離，茶多酚轉化液中組成成分復雜，含有大量的表型兒茶素及其他化合物，快速制備液相色譜采用C18填料，分離效率較高，采用粒徑20?40 Mi的填料，上樣量大，制備效率高。
[0027]本發明采用高壓制備液相色譜的方法，產物的雜質含量少，HPLC純度高。
[0028]本發明制備的產物含量高，HPLC純度大于99%，無機金屬、水分及揮發性等雜質含量低。
[0029]本發明可同時制備兒茶素C、表兒茶素EC、表沒食子兒茶素EGC、表兒茶素沒食子酸酯ECG、表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG、沒食子兒茶素GC和兒茶素沒食子酸酯CG等高純單體化合物。
[0030]本發明技術路線簡單，采用快速制備液相色譜結合高壓制備液相色譜分離純化，單次分離時間短，方法優化過程便捷。
[0031]本發明易于放大，高溫轉化、快速制備液相色譜及高壓制備液相色譜分離等過程單元均可進行克級至公斤級的制備。
[0032]本發明綠色環保，避免了傳統提取、萃取分離中使用乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等有機溶劑;本發明制備分離中使用的甲醇在旋轉蒸發過程中可以回收;本發明未引入無機鹽、重金屬等雜質。
【附圖說明】
[0033]圖1為沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG的化學結構。
[0034]圖2為沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG高純單體化合物的制備技術流程。
[0035]圖3為快速制備液相色譜分離綠茶茶多酚高溫轉化液的色譜圖。
[0036]圖4為高壓制備液相色譜分離沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG單體化合物粗品的色譜圖。
[0037]圖5為沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG高純單體化合物高效液相色譜法純度檢測的色譜圖，即^:純度為99.51%。
【具體實施方式】
[0038]以下結合附圖對本發明作進一步說明。
[0039]如圖2所示，茶葉及其制品中沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG的含量較低，本發明中采用綠茶茶多酚為原料，料液經高溫轉化，茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG部分地轉化為相應的異構體沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG，提高了料液中沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG的含量。在兒茶素單體化合物的制備分離中，需要考慮分離純化效率、成本以及是否環境友好等。傳統的方法如液液萃取技術雖然操作簡單，但提純效率差，有時還需要使用有毒溶劑等;硅膠柱