抗病毒雙鏈rna及其溫度敏感型凝膠制劑在治療和預防hsv-1所致疾病中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域中抗病毒雙鏈RNA及其溫度敏感型凝膠制劑在治療和預 防HSV-I所致疾病中的應用。
【背景技術】
[0002] I型單純瘤疹病毒化SV-1)感染常常會導致口腔及生殖器黏膜產生瘤疹和潰瘍。人 是HSV-I的唯一宿主，約80~90 %的人群感染過HSV-I dHSV-1主要造成口腔炎和嘴唇的瘤 疹，但越來越多的研究發現，HSV-I也能導致生殖器疾病，而且是導致生殖器疾病更為常見 的原因。一直W來，人們普遍認為70% W上的生殖器瘤疹是由2型單純瘤疹病毒化SV-2)引 起的。根據近10年來流行病學的調查，由HSV-I感染而導致的生殖器瘤疹，正在逐年增加。來 自美洲、歐洲和亞洲的最新數據表明，HSV-I的感染已經成為導致生殖器瘤疹的重要原因。 當病毒DNA穿過核膜進入細胞核后，HSV-Iinfected cell Polypeptide O(ICPO)最早被轉 錄和翻譯。成熟的ICPO進入細胞核后能結合多種及早期基因的啟動子，W促進其基因表達。 另外，ICPO還能通過抑制干擾素調節因子IRF3和IR巧的活性來抑制抗病毒細胞因子干擾素 (IFN)的表達。為了促進HSV-I能順利的復制，ICPO通過抑制RNAase L的表達來抑制被病毒 感染的細胞發生細胞調亡過程。除此之外，在病毒感染后期，ICPO會出核進入細胞質和新合 成的其他蛋白和病毒DNA-起組成新的病毒顆粒。ICP27是另一種極早期蛋白，它主要是參 與調控病毒蛋白的轉錄，mRNA的出核過程。HSV-I的另一個重要蛋白是肌酢激酶(TK)，它在 病毒DNA的合成過程中其重要作用。此外，在病毒從潛伏期復發的過程中，TK是第一個被表 達的基因，它可W促進其他極早期基因和早期基因的表達。目前用于臨床治療HSV-I感染性 疾病的藥物主要是口服核巧類藥物，如阿昔洛韋。當阿昔洛韋進入細胞后首先必須被服V-I 的TKS憐酸化成有活性的形式才能發揮抑制病毒的復制的作用。根據研究表明，近年來臨 床上出現的HSV-I對阿昔洛韋有抗性的病例中正是由于TK基因的突變導致的。此外服用運 些核巧類藥物會產生多種副作用，如損害神經系統和消化系統。
【發明內容】
[0003] 本發明所要解決的技術問題是如何治療和/或預防HSV-I所致疾病。
[0004] 為解決上述技術問題，本發明首先提供了雙鏈RNA、所述雙鏈RNA的修飾物或與所 述雙鏈RNA相關的生物材料在下述al)或a2)中的應用：
[0005] al)制備治療和/或預防服V-I所致疾病產品；
[0006] a2)治療和/或預防服V-I所致疾病；
[0007] 所述雙鏈RNA，名稱為SiRNA,其一條鏈的序列為序列表中序列1，另一條鏈的序列 為序列2;
[000引所述生物材料為下述Bl )-B10)中的任一種：
[0009] Bl)編碼所述雙鏈RNA的DNA分子或CDNA分子；
[0010] B2)含有BI)所述DNA分子的表達盒；
[0011] B3)含有Bl)所述DNA分子的重組載體；
[0012] B4)含有B2)所述表達盒的重組載體；
[001引 B5)含有Bl)所述DNA分子的重組微生物；
[0014] B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物；
[0015] B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0016] B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物；
[0017] B9)含有BI)所述DNA分子的轉基因動物細胞系；
[0018] B10)含有B2)所述表達盒的轉基因動物細胞系。
[0019] 上述應用中，所述雙鏈RNA的修飾物可為將所述雙鏈RNA經過y氣代、2/甲氧基、硫 代或y脫氧化學修飾或膽固醇修飾得到的物質。
[0020] 上述應用中，所述雙鏈RNA的修飾物可為對所述雙鏈RNA的U和C進行y甲氧基修飾 得到的物質，其中A和G均未被修飾。
[0021] 上述應用中，B2)所述的含有編碼所述雙鏈RNA的DNA分子的表達盒是指能夠在宿 主細胞中表達dsRNA21的DNA，該DNA不但可包括啟動所述雙鏈RNA轉錄的啟動子，還可包括 終止所述雙鏈RNA轉錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。
[0022] 可用現有的表達載體構建含有所述雙鏈RNA表達盒的重組載體。
[0023] 上述應用中，所述載體可為質粒、黏粒、隧菌體或病毒載體。
[0024] 上述應用中，所述微生物可為酵母、細菌、藻或真菌。
[0025] 上述應用中，所述轉基因動物細胞系不包括繁殖材料。
[0026] 上述應用中，所述HSV-I所致疾病可為口腔和/或生殖器瘤疹和/或潰瘍。
[0027] 為解決上述技術問題，本發明還提供了所述雙鏈RNA、所述雙鏈RNA的修飾物或所 述生物材料在下述bl)、b2)、b3)或b4)中的應用：
[002引 bl)制備抑制HSV-I復制產品；
[0029] b2)抑制服V-I復制；
[0030] b3)制備抑制HSV-I的基因表達產品；
[0031] b4)抑制服V-I的基因表達。
[0032] 上述應用中，所述服V-I的基因可為服V-I的ICPO基因、ICP27基因和/或TK基因。
[0033] 為解決上述技術問題，本發明還提供了利用所述雙鏈RNA、所述雙鏈RNA的修飾物 或所述生物材料制備的溫度敏感型凝膠制劑在前文所述al)、所述a2)、所述bl)、所述b2)、 所述b3)或所述b4)中的應用。
[0034] 上述應用中，所述溫度敏感型凝膠制劑對溫度敏感，可在環境溫度發生變化時凝 固和/或烙化。所述溫度敏感型凝膠制劑可包括所述雙鏈RNA、所述雙鏈RNA的修飾物或所述 生物材料與溫度敏感型凝膠；
[0035] 所述溫度敏感型凝膠可由泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、聚乙二醇-PLGA嵌段共聚 物、纖維素衍生物和膠原蛋白中的一種或兩種W上任意組合制備得到。所述溫度敏感型凝 膠在制備的過程中，可添加制備溫度敏感型凝膠所需的輔料。所述泊洛沙姆188的濃度為 50-350mg/ml，所述泊洛沙姆407的濃度為100-500mg/ml，所述聚乙二醇-PLGA嵌段共聚物的 濃度為l〇〇-350mg/ml，所述纖維素衍生物的濃度為l-300mg/ml。所述的纖維素衍生物選自 甲基纖維素、簇甲基纖維素鋼和徑丙基甲基纖維素中的一種或兩種W上任意組合。所述膠 原蛋白的濃度為50-100mg/ml，所述膠原蛋白選用魚皮和/或豬皮提取的膠原蛋白。所述溫 度敏感型凝膠W水為溶劑。
[0036] 上述應用中，所述溫度敏感型凝膠制劑還可包括體內轉染試劑，所述體內轉染試 劑可為mPEG-P化-P陽EA、聚乙締亞胺、線性聚乙締亞胺、脂質體、轉鐵蛋白或葉酸。
[0037] 上述應用中，所述溫度敏感型凝膠中還可添加有增溶劑，所述增溶劑選自乙醇、丙 二醇、聚乙二醇、環糊精類、十二烷基硫酸鋼和聚山梨醋類中的一種或兩種種W上任意組 合。其中乙醇的濃度可為50-350mg/ml，丙二醇的濃度可為50-350mg/ml，聚乙二醇的濃度可 為100-350mg/ml，環糊精類的濃度可為10-360mg/ml，十二烷基硫酸鋼的濃度可為5-50mg/ ml，聚山梨醋類的濃度可為5-50mg/ml;所述聚乙二醇為選自PEG300、PEG400和陽G600中的 一種或兩種W上任意組合;所述環糊精類為選自a-環糊精、0-環糊精、徑丙基-0-環糊精、徑 乙基-0-環糊精、二甲基-0-環糊精中的一種或兩種W上任意組合;所述聚山梨醋類為選自 吐溫-80，吐溫-60，吐溫-85，吐溫-40，吐溫-20的一種或兩種W上任意組合。
[0038] 為了改善所述溫度敏感型凝膠的口味，所述溫度敏感型凝膠中可包括濃度為0.1-550mg/ml的矯味劑;所述矯味劑為選自薦糖，山梨醇、甘露醇、木糖醇、丙二醇、甘油、薄荷 油、薄荷腦、枯子香精和香蕉香精中一種或一種W上任意組合。
[0039] 所述溫度敏感型凝膠制劑的抑值為5.0-9.0;抑調節用試劑可為S乙醇胺和/或氨 氧化鋼和/或氨氧化鐘。
[0040] 上述試劑均可從Sigma等試劑公司購買。
[0041] 所述溫度敏感型凝膠制劑還可W包含其它藥學上可接受的載體。本文所用的"藥 學上可接受的載體"應當與本發明藥物組合物中的凝膠和雙鏈核酸分子相容，即能與其共 混而不會在通常情況下大幅度降低藥物組合物在抑制基因表達方面的效果。可作為藥學上 可接受的載體或其組分的一些物質的其他例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和薦糖;淀粉，如玉 米淀粉和±豆淀粉;西黃著膠粉末;麥芽；明膠;滑石;固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸儀;硫 酸巧;植物油，如花生油、棉巧油、芝麻油、橄攬油、玉米油和可可油;多元醇，如甘油、甘露糖 醇;海藻酸;乳化劑，如Tween;潤濕劑，